Boya Etiketli Manyetik Mikroküreler Kullanılarak Çoklanmış Kantitatif Bakteri Tespiti

Özet

Bu video, farklı kümelere boyanmış karboksilatlı manyetik polistiren mikroküreler kullanan çoğullanmış kantitatif bakteri tespitini göstermektedir. Prosedür, boncuk-bakteri komplekslerinin oluşumunu, manyetik ayırmayı ve akış tabanlı analizi kapsar ve aynı reaksiyon kuyusunda birden fazla bakterinin hassas ve aynı anda miktar tayinini sağlar.

Protokol

1. Yakalama Antikorlarının MagPlex Mikrokürelerine Kovalent Eşleşmesi

Her yakalama antikoru, aşağıda açıklandığı gibi iki aşamalı bir prosedür kullanılarak belirli bir karboksilatlı manyetik mikroküre setine konjuge edilir.

>NOT: Mikroküre birleştirme için gerekli tüm reaktifleri, tamponları ve malzemeleri içeren bir birleştirme kiti de mevcuttur (bkz.

1. Stok bağlantısız mikroküre süspansiyonunu, microspheres.
   ile birlikte verilen ürün bilgi sayfasında açıklanan talimatlara göre yeniden askıya alın not: Yeniden askıya alma talimatları, stok mikroküre şişelerinizin boyutuna ve hacmine bağlı olacaktır.
2. Stok mikroküreciklerin 2.5 x 10^6'sını önerilen bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın (bkz. MALZEME TABLOSU).
3. Tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca ayrılmanın gerçekleşmesine izin verin.
4. Tüp hala manyetik ayırıcıya yerleştirilmişken, süpernatanı çıkarın.
   not: Mikro kürecikleri rahatsız etmemeye özen gösterin.
5. Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve mikroküreleri 100 μL dH₂O'da girdap ve 20 saniye boyunca sonikasyon ile yeniden süspanse edin.
6. 3. ve 4. adımları tekrarlayın.
7. Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yıkanmış mikroküreleri 80 μL 0.1 M sodyum fosfat monobazik, pH 6.2 girdap ve sonikasyon ile 20 saniye boyunca yeniden süspanse edin.
8. Mikrokürelere 10 μL 50 mg / mL N-hidroksisülfosüksinimid (sülfo-NHS) (0.1 M sodyum fosfat monobazik, pH 6.2 içinde seyreltilmiş) ekleyin ve bir girdap ile hafifçe karıştırın.
9. Mikrokürelere 10 μL 50 mg / mL 1-Etil-3- [3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür (EDC) (0.1 M sodyum fosfat monobazik içinde seyreltilmiş, pH 6.2) ekleyin ve bir girdap ile hafifçe karıştırın.
10. 10 dakikalık aralıklarla girdap ile hafifçe karıştırarak oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
11. Tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca ayrılmanın gerçekleşmesine izin verin.
12. Tüp hala manyetik ayırıcıya yerleştirilmişken, süpernatanı çıkarın.
    not: Mikro kürecikleri rahatsız etmemeye özen gösterin.
13. Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve mikroküreleri 250 μL fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4'te girdap ve sonikasyon ile yaklaşık 20 saniye boyunca yeniden süspanse edin.
14. Tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca ayrılmanın gerçekleşmesine izin verin.
15. Tüp hala manyetik ayırıcıya yerleştirilmişken, süpernatanı çıkarın.
    not: Mikro kürecikleri rahatsız etmemeye özen gösterin.
16. Toplam iki yıkama için 13-15 arasındaki adımları tekrarlayın.
17. Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve aktive edilmiş ve yıkanmış mikroküreleri 100 μL PBS, pH 7.4'te girdap ve sonikasyon ile yaklaşık 20 saniye boyunca yeniden süspanse edin.
18. Yeniden süspanse edilmiş mikrokürelere 12.5 μg yakalama antikoru ekleyin (yani, 5 μg / 1 milyon mikroküre).
    not: Yakalama için monoklonal antikorlar tercih edilir, ancak poliklonal antikorlar da kullanılabilir.
    NOT: 1 milyon boncuk başına 5 μg protein tipik olarak iyi performans gösterir, ancak optimum tahlil performansı elde etmek için miktarı titre etmenizi öneririz.
19. PBS, pH 7.4 ile toplam hacmi 500 μL'ye getirin.
20. Birleştirme reaksiyonunu bir girdap ile karıştırın.
21. Karanlıkta oda sıcaklığında döndürerek karıştırarak 2 saat inkübe edin.
22. Tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca ayrılmanın gerçekleşmesine izin verin.
23. Tüp hala manyetik ayırıcıya yerleştirilmişken, süpernatanı çıkarın.
    not: Mikro kürecikleri rahatsız etmemeye özen gösterin.
24. Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve birleştirilmiş mikroküreleri 1 ml PBS, pH 7.4'te %0.02 Tween-20, %0.1 sığır serum albümini (BSA),% 0.05 sodyum azid (PBS-TBN) girdap ve sonikasyon ile 20 saniye boyunca yeniden süspanse edin.
25. Tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca ayrılmanın gerçekleşmesine izin verin.
26. Tüp hala manyetik ayırıcıya yerleştirilmişken, süpernatanı çıkarın.
    not: Mikro kürecikleri rahatsız etmemeye özen gösterin.
27. Toplam iki yıkama için 24-26 arasındaki adımları tekrarlayın.
28. Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve birleştirilmiş mikro küreleri 500 μL PBS-TBN.
    not: Bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak kurtarılan mikrokürelerin sayısını belirleyin.
29. Birleştirilmiş mikro küreleri karanlıkta 2-8°C'de buzdolabında saklayın.
    not: Kaplin verimliliğini doğrulamak için bir protokol de mevcuttur.

2. Tespit Antikorlarının Biyotin Etiketlemesi

1. Tespit antikorları, antikor molekülü başına 4-6 biyotin grubu elde etmek için üreticinin talimatlarına göre 20 kat molar fazla biyotin reaktifi ile EZ-Link sülfosüksinimidil-6- (biyotinamido) hekzanoat kullanılarak biyotin ile etiketlendi.
   not: Poliklonal antikorlar tipik olarak tespit için kullanılır, ancak yakalama antikorundan farklı bir epitop için spesifikse monoklonal antikorlar da kullanılabilir.
   not: Alternatif olarak, tespit için ticari olarak temin edilebilen biyotinile antikorlar kullanılabilir.

3. Çoğullanmış Yakalama Sandviç İmmünoassay ile Organizmaların Tespiti

Yukarıdaki 1 ve 2'de üretilen birleştirilmiş mikroküre setleri ve etiketli tespit antikorları, bir numunede bulunan bakterileri tespit etmek ve miktarını belirlemek için çoğullanmış bir yakalama sandviç immünolojik testinde kullanılır. Tahlil iş akışına genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmektedir.

1. 2-8ºC depolamadan antikora bağlı MagPlex boncuk setlerinin stok şişelerini seçin.
2. 20 saniye boyunca girdap ve sonikate.
3. PBS-TBN'de her bir boncuk seti, her reaksiyon kuyusu için 50 μL başına 50 mikroküre başına 50 mikroküre nihai konsantrasyonda (50.000 boncuk/set/ml) olacak şekilde çalışan bir çoğullanmış boncuk karışımı hazırlayın.
   not: Çalışma boncuğu karışımı için hazırlık parametrelerini belirlemek için bir elektronik tablo kullanın.
   not: Tahlil ve cihaz performansını izlemek için dahili kontrol boncukları (RP1 Monitör Mikro Küreleri) de dahil edilebilir.
4. 50 μL çalışma boncuğu karışımını 96 oyuklu bir plakanın uygun kuyucuklarına pipetleyin.
5. 50 μL standart veya numuneyi uygun kuyucuklara pipetleyin.
6. Her arka plan kuyucuğuna 50 μL PBS-TBN pipetleyin.
7. Boncukları ışıktan korumak için plakayı bir folyo conta ile örtün ve 800 rpm'de çalkalayarak oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcı üzerinde 1 saat inkübe edin.
8. Plakayı 1 dakika boyunca manyetik bir plaka ayırıcı üzerine yerleştirin.
9. Plakayı manyetik plaka ayırıcı üzerinde tutarak, folyoyu dikkatlice çıkarın ve kuyucukları boşaltmak için plakayı ters çevirin, ardından kalın bir laboratuvar kağıdı havlu tabakası üzerinde 3-4 kez kuruması için hafifçe vurun.
   not: Alternatif olarak, çok kanallı bir pipetleyici kullanarak kuyucukları manuel olarak aspire edin veya otomatik bir plaka yıkayıcı kullanın.
10. Her kuyucuğa 200 μL PBS-TBN eklemek için çok kanallı bir pipetleyici kullanın ve 800 rpm'de bir plaka çalkalayıcı üzerinde 1 dakika çalkalayın.
11. Plakayı 1 dakika boyunca manyetik bir plaka ayırıcı üzerine yerleştirin.
12. Plakayı manyetik plaka ayırıcı üzerinde tutarak, kuyucukları boşaltmak için plakayı ters çevirin, ardından kalın bir laboratuvar kağıt havlu tabakası üzerinde 3-4 kez kuruması için hafifçe vurun.
    not: Alternatif olarak, çok kanallı bir pipetleyici kullanarak kuyucukları manuel olarak aspire edin veya otomatik bir plaka yıkayıcı kullanın.
13. Toplam iki yıkama için 10-12. adımları tekrarlayın.
    not: Reaksiyonun olası seyreltilmesini önlemek için bir sonraki adıma geçmeden önce mümkün olduğunca fazla tamponu çıkarın.
14. Her bir oyuğa 50 μL tahlil tamponu eklemek için çok kanallı bir pipetleyici kullanın ve 800 rpm'de bir plaka çalkalayıcı üzerinde 1 dakika çalkalayın.
15. Biyotinile tespit antikorunu PBS-TBN'de 4 μg / ml'ye seyreltin.
16. Her oyuğa 50 μL seyreltilmiş tespit antikoru ekleyin.
17. Boncukları ışıktan korumak için plakayı bir folyo conta ile örtün ve 800 rpm'de çalkalayarak oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcı üzerinde 1 saat inkübe edin.
18. Plakayı 1 dakika boyunca manyetik bir plaka ayırıcı üzerine yerleştirin.
19. Plakayı manyetik plaka ayırıcı üzerinde tutarak, kuyucukları boşaltmak için plakayı ters çevirin, ardından kalın bir laboratuvar kağıt havlu tabakası üzerinde 3-4 kez kuruması için hafifçe vurun.
    not: Alternatif olarak, çok kanallı bir pipetleyici kullanarak kuyucukları manuel olarak aspire edin veya otomatik bir plaka yıkayıcı kullanın.
20. Adım 10-12.
    'da açıklanan prosedürü izleyerek her bir kuyuyu iki kez yıkayın not: Reaksiyonun olası seyreltilmesini önlemek için bir sonraki adıma geçmeden önce mümkün olduğunca fazla tamponu çıkarın.
21. Her bir oyuğa 50 μL tahlil tamponu eklemek için çok kanallı bir pipetleyici kullanın ve 800 rpm'de bir plaka çalkalayıcı üzerinde 1 dakika çalkalayın. Streptavidin, R-Fikoeritrin Konjugatı (SAPE).
22. SAPE raportörünü tahlil tamponunda 4 μg/mL'ye seyreltin.
23. Her oyuğa 50 μL seyreltilmiş SAPE ekleyin.
24. Boncukları ve SAKE'yi ışıktan korumak için plakayı bir folyo conta ile örtün ve 800 rpm'de çalkalayarak oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcı üzerinde 30 dakika inkübe edin.
25. Plakayı 1 dakika boyunca manyetik bir plaka ayırıcı üzerine yerleştirin.
26. Plakayı manyetik plaka ayırıcı üzerinde tutarak, kuyucukları boşaltmak için plakayı ters çevirin, ardından kalın bir laboratuvar kağıt havlu tabakası üzerinde 3-4 kez kuruması için hafifçe vurun.
    NOT: Alternatif olarak, çok kanallı bir pipetleyici kullanarak kuyucukları manuel olarak aspire edin veya otomatik bir plaka yıkayıcı kullanın.
27. Adım 10-12'de açıklanan prosedürü izleyerek her kuyuyu iki kez yıkayın.
28. Her kuyucuğa 100 μL PBS-TBN ekleyin ve 800 rpm'de bir plaka çalkalayıcı üzerinde 1 dakika çalkalayın.
29. Luminex analizöründe her reaksiyonun 50 μL'sini analiz edin (kullanılan analizörün Kullanım Kılavuzuna göre), analiz için boncuk seti başına en az 50 boncuk toplayın. xMAP INTELLIFLEX'in® kısa bir açıklaması aşağıda verilmiştir.
    1. Ekranın sol üst köşesindeki açılır menüyü seçin ve Plaka Yapılandırması'na gidin.
    2. Plakayı Çalıştır'ı seçin.
    3. Plaka taşıyıcıyı çıkarmak için Çıkar simgesini seçin.
    4. Plakayı plaka taşıyıcıya yükleyin ve plaka taşıyıcıyı geri çekmek için Geri Çek'i seçin.
    5. Plakayı çalıştırmak için Çalıştır simgesini seçin.

Sonuçlar

Şekil 1: Çoğullanmış yakalama sandviç immünoassay iş akışı. Her bir oyuğa antikorla bağlı mikrokürelerin çoğullanmış bir karışımı dağıtılır ve numune eklenir. 1 saat inkübasyondan sonra, reaksiyonlar yıkanır ve biyotinile tespit antikorları eklenir. 1 saatlik bir inkübasyondan sonra, reaksiyonlar tekrar yıkanır ve SAPE raportörü eklenir. Reaksiyonlar 30 dakika inkübe edilir, yıkanır v...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
MagPlex Mikro Küreler®	Luminex® Teknolojisi	MC100xx-YY	Bireysel katalog numaraları için web sitesine bakın (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#order)
1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri	Eppendorf™ Belediyesi	22431081	Protein LoBind®
0,1 M monobazik sodyum fosfat (NaH2PO4), pH 6,2	MilliporeSigma	S3139 Serisi	Aktivasyon tamponu
1-Etil-3 - [3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür (EDC)	Termo Bilimsel™	Delmek™ 77149
N-hidroksisülfosüksinimid (Sülfo-NHS)	Termo Bilimsel ™	Pierce™ 24510
Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4	MilliporeSigma	P3813 Serisi	Kaplin tamponu
xMAP® Antikor Birleştirme Kiti	Luminex® Teknolojisi	40-50016	Mikroküre bağlantısı için isteğe bağlı kit mevcuttur.
Anti-Escherichia coli O157:H7 antikoru	Sera Bakımı	5310-0326	Poliklonal, hem yakalama hem de algılama için kullanılır
Anti-Salmonella CSA-Plus antikoru	Sera Bakımı	5310-0321	Poliklonal, hem yakalama hem de algılama için kullanılır
Anti-Campylobacter spp. antikoru	Sera Bakımı	5310-0324	Poliklonal, hem yakalama hem de algılama için kullanılır
Anti-Listeria antikoru	Sera Bakımı	5310-0319	Poliklonal, cinse özgü, hem yakalama hem de algılama için kullanılır
PBS, pH 7.4, %0.02 Tween-20, %0.1 BSA, %0.05 sodyum azid (PBS-TBN) içerir	MilliporeSigma	P3563 A7888 S8032 Serisi	%1'e kadar BSA kullanılabilir
Anti-Escherichia coli O157:H7 Antikoru	Sera Bakımı	5310-0326	Poliklonal
(EZ-Link Sülfo-NHS-LC-Biotin) (Delmek).	Termo Bilimsel™	A39257
E. coli O157:H7	Sera Bakımı	5370-0013	Isıyla öldürüldü
Salmonella serotip Typhimurium	Sera Bakımı	5370-0002	Isıyla öldürüldü
Campylobacter jejuni	Sera Bakımı	5370-0011	Isıyla öldürüldü
Listeria monocytogenes (Listeria monocytogenes)	Sera Bakımı	5370-0010	Isıyla öldürüldü
Streptavidin, R-Phycoerythrin Konjugatı (SAPE)	Termo Bilimsel™	S866 Serisi

Serisi