Nötrofil Proteinlerinin İzolasyonu ve Sindirimi

Özet

Bu video, daha sonra işlenen ve daha küçük peptitlere sindirilen nötrofillerden protein izolasyonunu göstermektedir. Bu peptitler gelecekteki analizler için kullanılabilir.

Protokol

1. Nötrofil Hücre Toplama ve Lizis

1. Nötrofil ile farklılaşmış HL60 hücrelerini, numuneleri 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyerek 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
   not: Nötrofiller, farklılaşmadan sonra 3.5 x 10⁵ hücre / mL'lik bir birleşim noktasında olmalıdır. Toplam proteom ekstraksiyonu için yaklaşık beş milyon hücre hasat edin.
2. Süpernatanı atın ve tüpe 15 mL fosfat tamponlu çözelti (PBS) ekleyin.
3. Numuneleri 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
4. 1.2'den 1.3'e kadar olan adımları tekrarlayın.
   not: Hücre numuneleri, deneysel zaman çerçevesine bağlı olarak sıvı nitrojen ile hızlı dondurulabilir ve Adım 1.4'ten sonra -80°C'de saklanabilir.
5. Her numuneye 300 μl soğuk 100 mM Tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorür (Tris-HCl) pH 8.5 proteinaz inhibitör kokteyli (PIC) tableti ekleyin.
6. Vorteks örnekleri kısaca.
7. %2'lik bir nihai konsantrasyona 1/10 hacimce %20 SDS ekleyin.
8. Hücre örneklerini parçalamak için, bir buz banyosunda 30 saniye boyunca ve 30 saniye boyunca% 10 güçte beş döngü boyunca sonikat örneklerini araştırın.
9. Numuneleri kısa bir dönüşte santrifüjleyin (5-10 saniye boyunca maksimum hız).
   not: Hücre kalıntısının peletlenmesine izin vermeyin. Tüp duvarlarından spreyi toplamak için kısa bir sıkma kullanın.
10. Numuneleri 15 mL'lik tüpten 2 mL'lik bir tüpe aktarın.
11. 10 mM DTT'lik bir nihai konsantrasyona 1/10 hacim 1 M stok Dithiothreitol (DTT) ekleyin.
12. Vorteks örnekleri kısaca.
13. Numuneleri 95 ° C'de 800 rpm'de çalkalayarak 10 dakika inkübe edin.
14. 10 dakika sonra numuneleri oda sıcaklığına soğutun.
    not: Soğutma işlemini hızlandırmak için numuneler buza yerleştirilebilir.
15. 55 mM IAA.
    'lik bir nihai konsantrasyona 1/10 hacim 0.55 mM İyodoasetamid (IAA) ekleyin not: IAA'yı ışığa maruz bırakmaktan kaçınmak için karanlıkta Adım 1.15'i gerçekleştirin.
16. Vorteks örnekleri kısaca.
17. Numuneleri oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika inkübe edin.
18. %80'lik son konsantrasyonda %100 buz gibi aseton ekleyin ve numuneleri gece boyunca -20 °C'de saklayın.
    not: İhtiyaç halinde -20 °C'de depolama iki haftaya kadar yapılabilir.

2. Nötrofil Proteinlerinin Sindirimi

1. Hücre peletlerini çökeltmek için numuneleri 13.500 rpm'de 4°C'de 10 dakika santrifüjleyin.
2. Süpernatanı atın ve hücre peletlerini 500 μl %80 buz gibi soğuk aseton ile yıkayın.
3. Numuneleri 13.500 rpm'de 4°C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
4. 2.1 ila 2.3 arasındaki adımları tekrarlayın.
5. Havayla kuruyan peletler.
6. Kuruduktan sonra, 100 μl 8 M Üre / 40 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) hücre peletine ekleyin ve 4 ° C'lik bir su banyosunda 30 saniye boyunca 30 saniye boyunca su sonikatına ekleyin, protein peletlerini yeniden çözündürmek için 15 döngü boyunca.
7. Sığır serum albümini (BSA) triptofan testi (veya eşdeğeri) kullanılarak, üreticinin talimatlarına göre protein konsantrasyonunu ölçer.
8. Numuneyi 2 M Üre'lik nihai konsantrasyona seyreltmek için 300 μl amonyum bikarbonat (ABC) ekleyin.
9. 50 μg proteini sindirmek için, buz üzerindeki numunelere 1:50 Trypsin/LysC (enzim/protein oranı) ekleyin - numuneleri hafifçe vurarak karıştırın.
10. Sindirimi gerçekleştirmek için numuneleri gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.

Sonuçlar

Şekil 1. Kütle spektrometresi tabanlı proteomik profilleme için nötrofillere farklılaştırılan HL60 hücrelerinin iş akışı. Farklılaşmamış ve farklılaşmış (DMSO kimyasal stimülasyonu yoluyla) HL60 hücre hatları kültürlendi, toplandı ve toplam proteom ekstraksiyonu için işlendi. Proteinler Tripsin / LysC ile sindirildi ve peptitler C18 AŞAMA uçları kullanılarak saflaştırıldı, ardından LC-MS / MS ile tesp...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
15 ml Falcon Tüpü	VWR (VWR)	470225-000
25 mL Serolojik	Balıkçı Bilimsel	14955235
Amonyum Bikarbonat (ABC)	ThermoFisher Bilimsel	A643-500
aseton	Sigma Aldrich	34850-1L
BSA tahlil kiti	VWR (VWR)	CA62408-940
Santrifüj 5810 R	Sigma Aldrich	EP022628188
Ditiyotreitol (DTT)	ThermoFisher Bilimsel	R0861	1M DTT alikot stoğu hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın
Fetal Sığır Serumu (FBS)	ThermoFisher Bilimsel	12483020	Çözdürün, alikotları hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın
Isıtma bloğu
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma Aldrich	H3375	8M Üre/40m HEPES alikotları hazırlayın, -20 °C'de saklayın
İyodoasetamid (IAA)	Balıkçı Bilimsel	AAA1471514	0,55 milyon IAA alikot stoğu hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın. Işığa maruz kalmaktan kaçının
L-glutamin	Balıkçı Bilimsel	25030081	Çözdürün, alikotları hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın
Sıvı nitrojen
LoBind Mikrosantrifüj tüpleri	Eppendorf Belediyesi	13-698-794
Penisilin Streptomisin, Amfoterisin	Sigma Aldrich	A5955	Çözdürün, alikotları hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın
Nötrofil ile farklılaşmış HL60 hücreleri
Fosfat tamponlu çözelti (PBS)	Biyodükkan	PBS408	Oda sıcaklığında saklayın
Prob sonikatörü	Balıkçı Bilimsel	100-132-894
Proteaz inhibitörü kokteyl (PIC) tableti	Sigma Aldrich	5892791001	4°C'de saklayın
dev/dak 1640	ThermoFisher Bilimsel	11875093	4°C'de saklayın
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)	ThermoFisher Bilimsel	J18220 (İngilizce). A1	% 2 SDS çözeltisi hazırlayın
SpeedVac Santrifüj	Eppendorf Belediyesi	07-748-15
T75 Şişeler	ThermoFisher Bilimsel	156499
Tris HCL pH 8.5	Balıkçı Bilimsel	BP152-1	4°C'de saklayın
Ultrasonik banyo	VWR (VWR)	97043-960
üre	Biyodükkan	URE001.1

Serisi · · Serisi · Serisi · Serisi Serisi · Sertifikası Serisi