Peptitlerin tuzdan arındırılması ve saflaştırılması için bir STAGE İpucu prosedürü

1. Peptitlerin Saflaştırılması ve Tuzdan Arındırılması

1. Bir STop And Go Ekstraksiyon (STAGE) ucu oluşturmak için her peptit numunesi için 200 μl'lik bir pipet ucuna üç kat C18 reçinesi koyun.
2. Numunelere 1/10 durdurma çözeltisi (%20 asetonitril [ACN)] ve %6 trifloroasetik asit [TFA]) ekleyin.
3. Pelet çökeltme için numuneleri 13.200 rpm'de 10 dakika santrifüjleyin.
4. Süpernatanı yeni bir 2 mL'lik tüpe aktarın ve peleti atın.
5. Aşama uçlarını 100 μl% 100 ACN ile yıkayın.
6. STAGE uçlarını 1000 x g'da 2 dk.
   santrifüjleyin not: STAGE uçlarını tüm sıvı C18 reçinesinden geçene kadar santrifüjleyin.
7. STAGE uçlarını 50 μl Tampon B (%80 ACN, %0,5 Asetik asit ve ddH₂O) ile yıkayın.
8. STAGE uçlarını 1000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
9. STAGE uçlarını 200 μl Tampon A (%2 ACN, %0.1 TFA, %0.5 Asetik asit ve ddH₂O) ile yıkayın.
10. Aşama uçlarını 2 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleyin.
11. Örnekleri STAGE uçlarına yükleyin.
12. Numuneleri 1000 x g'da 3-5 dakika santrifüjleyin.
13. STAGE uçlarını 200 μl Tampon A ile yıkayın.
14. 1000 x g'da 3-5 dakika santrifüjleyin.
15. Her bir STAGE ucuna 50 μl Tampon B ekleyin
16. Bir şırınga kullanarak, Tampon B içeren numuneleri 0.2 mL'lik bir PCR şerit tüpüne boşaltın.
17. Numuneler ayrıştırıldıktan sonra, peptitleri 45 dakika boyunca bir vakum santrifüjü kullanarak kurutun.
18. Numuneler kuruduktan sonra, MS.
    not: Peptit depolamasının iki haftadan fazla sürmesi gerekiyorsa, -20°C'de saklamanızı öneririz.
19. Numuneyi yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (MS) üzerinde çalıştırın.
    not: Numune ölçüm parametreleri (örn. yüklenen numune miktarı, sıvı kromatografi gradyan uzunluğu, çözünürlük) kullanılan enstrümantasyona bağlı olacaktır.

2. Nötrofillerin Proteomik Profillemesi

1. Ham veri işleme
   1. MS'den elde edilen Ham veri dosyalarını MaxQuant'a yükleyin.
   2. Yazılım, aşağıdan yukarıya, veriye bağlı toplama dosyalarıyla çalışacak şekilde tasarlanmıştır ve bu tür örnekler için birçok varsayılan parametre optimize edilmiştir. Varsayılan parametreler arasında Sindirim (Tripsin P), metiyonin oksidasyonunun değişken modifikasyonları (oksidasyon (M)) ve proteinlerin N-asetilasyonu (Asetil (Protein N-terimi)) ve sisteinin karbamidometilasyonunun sabit modifikasyonları (karbamidometil (C)) bulunur.
   3. Bu parametrelerde yapılan ayarlamalar arasında etiketsiz miktar tayini (LFQ; minimum oran sayısını 1 olarak ayarlayın), Koşular Arası Eşleştirme (yani açık / kapalı) ve protein başına tanımlanan minimum peptit sayısı (2'ye ayarlamayı öneririz) bulunur.
   4. Genel parametrelerde, sıra tanımlaması için FASTA dosyasını içe aktarın. Bu deney için Uniprot veri tabanından Homo sapiens (İnsan) (UP000005640) FASTA dosyası kullanılmıştır. not: Kayıt tutmak için aşağıdaki bilgileri kaydedin: Organizma Kimliği = 9606; protein sayısı = 79.740; dosya indirme tarihi.
   5. İşleme için kullanılacak bilgisayar çekirdeği sayısını ayarlayın ve Başlat'ı seçin.
   6. MaxQuant tamamlandıktan sonra, diğer dosyalarla birlikte 'birleşik' bir klasör oluşturulacaktır.
      not: Diğer dosyalar peptitleri, modifikasyonları vb. tanımlamak için kullanılabilir ve tüm veri kümesini Proteome Xchange (PRIDE) dahil olmak üzere veri havuzlarına yüklemek için gerekli olabilir.
2. Perseus'ta veri analizi ve görselleştirme
   1. 'proteingroups.txt' Perseus'a yükleyin ve 'Ana' penceresi için tüm LFQ yoğunluk dosyalarını seçin.
      not: Temel bilgiler doğrudan Perseus pencerelerine aktarılır, ancak diğer bilgilerin (örneğin, değişiklik siteleri) manuel olarak eklenmesi gerekebilir.
   2. Yalnızca site tarafından tanımlanan kirleticileri, ters peptitleri ve peptitleri kaldırarak satırları filtreleyin.
   3. Verileri günlük₂(x) ile dönüştürün.
   4. Her bir replikatta tespit edilen protein sayısını gözlemlemek için sayısal bir Venn diyagramı oluşturun.
   5. Her örnek için kategorik ek açıklamalar ayarlayın.
      not: İstatistiksel amaçlar için, bir biyolojik numunenin tüm kopyaları aynı ada sahip olmalıdır.
   6. Satırları, replikaların %>50'sinde ve en az bir grup içinde tanımlanan protein ile geçerli değerlere göre filtreleyin.
      not: Geçerli değerlere göre filtreleme, deney kurulumuna ve hedeflerine bağlı olarak daha katı olabilir (örneğin, protein tüm örneklerde bulunmalıdır).
   7. LFQ için eksik değerleri değiştirmek için, normal dağılımdan atama gerçekleştirilebilir.
      NOT: varsayılan parametreler LFQ verileri için optimize edilmiştir ancak istenildiği gibi ayarlanabilir.
   8. Protein satırlarına ek açıklama bilgileri ekleyin. txt.gz FASTA dosyasını (Perseus web sitesinden alınan) 'bin', 'conf' ve 'annotation' klasörlerine ekleyin ve belirli terimleri (örneğin, protein adları, gen adları, gen ontolojisi) getirin.
   9. Matris artık tamamlanmıştır ve test edilen koşullar arasında protein bolluğundaki önemli değişiklikleri belirlemek için istatistiksel testler (örneğin, ANOVA, t-testleri) için kullanılabilir. Görselleştirme araçlarının diğer biçimleri arasında temel bileşen analizi grafikleri, ısı haritaları ve kategori zenginleştirme yer alır.
      not: Ek açıklama bilgileri ayrıca UniProt'tan indirilebilir ve Perseus çerçevesine entegre edilebilir.