$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Psödotip tabanlı nötralizasyon testi
NOT: pMN, SARS-CoV-2 Spike'a karşı yönlendirilmiş antikorlar içeren insan nekahet serum örnekleri yoluyla psödotip virüs (PV) aracılı transdüksiyonun inhibisyonudur.
- Çok kanallı bir pipet yardımıyla 96 oyuklu beyaz bir plakada, 50 μl Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM),% 10 fetaval sığır serumu (FBS),% 1 penisilin / streptomisin (Pen / Strep) B'den H'ye, sütun 1-12'ye ekleyin.
- Toplam 100 μl DMEM /% 10 FBS /% 1 P / S hacminde A satırı, sütun 2-10'un kuyularına 5 μl nekahet serumu ekleyin. Bilinen miktarda ekleyin (ör., 5 μl) pozitif (NIBSC 20/162 kalibar, HICC-havuz 2 veya HICC havuz 3) ve negatif antiserum (2019 öncesi alınan hasta serumları) kontrol olarak A11 ve A12 kuyularına.
- Sıra A kuyucuklarından 50 μl'yi çıkarın ve altındaki tüm kuyucuklardan iki kat seri seyreltme yapın.
- Her seyreltme adımında, yukarı ve aşağı pipetleyerek ve hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat ederek 5-10 kez karıştırmak için çok kanallı bir pipet kullanın.
- Seri seyreltme tamamlandıktan sonra, her bir kolonun son kuyucuğundan son 50 μl atılmalıdır.
NOT: Bu noktada, her kuyucuk 50 μl karışık DMEM ve hasta serumu veya kontrol serumlarının seri dilüsyonlarını içermelidir.
- Kuyu duvarlarında sıvı kalmadığından emin olmak için plakayı 500 rpm'de 1 dakika santrifüjleyin.
- Psödotip titrasyon yoluyla elde edilen verileri kullanarak, SARS-CoV-2 PV'nizi 50 μl'de 5 μl'de 5 x 106 RLU elde etmek için seyreltmek için gereken DMEM miktarını hesaplayın ve toplam hacmi 5 ml'dir.
- Bu seyreltilmiş PV çözeltisini çok kanallı pipeti kullanarak bir pipet havuzunda karıştırın ve A6-A12 kuyuları (yalnızca hücre kontrolü) hariç, plakadaki her bir oyuğa 50 μl alikot edin. A1-A6, yalnızca PV kontrolü olarak hizmet edecektir.
- Kuyu duvarlarında virüs kalmadığından emin olmak için plakayı 500 rpm'de 1 dakika santrifüjleyin.
- Plakaları 37 °C'de 1 saat boyunca %5 karbondioksit (CO2) inkübe edin ve serumun SARS-CoV-2 glikoproteinini bağlaması için zaman tanıyın.
- Anjiyotensin dönüştürücü enzim 293 (ACE17) ekspresyon plazmidi ve transmembran serin proteaz 2 (TMPRSS2) ekspresyon plazmidleri ile transfekte edilmiş HEK 24T/24 hedef hücrelerinden oluşan bir plaka hazırlayın.
- Kültür ortamını plakadan çıkarın.
- Hücre ayrılmasını ve atılmasını önlemek için tabağın bir tarafında 2 ml PBS ile plakayı iki kez yıkayın.
- Plakaya 2 ml tripsin ekleyin ve hücreler ayrılana kadar plakayı inkübatöre koyun.
- Hücreler ayrıldıktan sonra, tripsin aktivitesini söndürmek ve hücreleri nazikçe yeniden süspanse etmek için plakaya 6 ml DMEM /% 10 FBS /% 1 penisilin / streptomisin ekleyin.
- TC20TM Otomatik Hücre Sayacı veya sayma odası sürgüsü kullanarak hücreleri sayın ve her bir oyuğa toplam 50 μl hacminde 1 x10 4 hücre ekleyin.
- Plakayı 48-72 saat, 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe edin.
Kültür - ortamını tüm kuyucuklardan çıkararak ve 25 μl 1: 1 PBS karışımı ekleyerek bir GloMax® Navigator Mikroplaka Luminometre üzerinde Bright Glo TM lusiferaz test sistemini kullanarak plakayı okuyun: Bright GloTM lusiferaz tahlil reaktifi.
- Luminometre tarafından sağlanan ham verilerden, yerleşik protokolleri kullanarak yarı maksimal inhibitör konsantrasyonu (IC50) nötralize edici antikor titrelerini hesaplayın. 1:40 seyreltmenin altındaki IC50 değerleri negatif olarak kabul edilir. Veriler alternatif olarak AutoPlate kullanılarak da değerlendirilebilir.