Fonksiyonel SARS-CoV-2 Nötralize Edici Antikorların Değerlendirilmesi

Özet

Bu video, SARS-CoV-2 virüslerini nötralize etmede serum etkinliğini ölçen bir nötralizasyon testini göstermektedir. Nötralizasyon titresini ortaya çıkaran psödotiplenmiş virüsleri, serum seyreltmesini ve lüminesans tabanlı nicelemeyi içerir.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Psödotip tabanlı nötralizasyon testi

NOT: pMN, SARS-CoV-2 Spike'a karşı yönlendirilmiş antikorlar içeren insan nekahet serum örnekleri yoluyla psödotip virüs (PV) aracılı transdüksiyonun inhibisyonudur.

1. Çok kanallı bir pipet yardımıyla 96 oyuklu beyaz bir plakada, 50 μl Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM),% 10 fetaval sığır serumu (FBS),% 1 penisilin / streptomisin (Pen / Strep) B'den H'ye, sütun 1-12'ye ekleyin.
2. Toplam 100 μl DMEM /% 10 FBS /% 1 P / S hacminde A satırı, sütun 2-10'un kuyularına 5 μl nekahet serumu ekleyin. Bilinen miktarda ekleyin (ör., 5 μl) pozitif (NIBSC 20/162 kalibar, HICC-havuz 2 veya HICC havuz 3) ve negatif antiserum (2019 öncesi alınan hasta serumları) kontrol olarak A11 ve A12 kuyularına.
3. Sıra A kuyucuklarından 50 μl'yi çıkarın ve altındaki tüm kuyucuklardan iki kat seri seyreltme yapın.
4. Her seyreltme adımında, yukarı ve aşağı pipetleyerek ve hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat ederek 5-10 kez karıştırmak için çok kanallı bir pipet kullanın.
5. Seri seyreltme tamamlandıktan sonra, her bir kolonun son kuyucuğundan son 50 μl atılmalıdır.
   NOT: Bu noktada, her kuyucuk 50 μl karışık DMEM ve hasta serumu veya kontrol serumlarının seri dilüsyonlarını içermelidir.
6. Kuyu duvarlarında sıvı kalmadığından emin olmak için plakayı 500 rpm'de 1 dakika santrifüjleyin.
7. Psödotip titrasyon yoluyla elde edilen verileri kullanarak, SARS-CoV-2 PV'nizi 50 μl'de 5 μl'de 5 x 10⁶ RLU elde etmek için seyreltmek için gereken DMEM miktarını hesaplayın ve toplam hacmi 5 ml'dir.
8. Bu seyreltilmiş PV çözeltisini çok kanallı pipeti kullanarak bir pipet havuzunda karıştırın ve A6-A12 kuyuları (yalnızca hücre kontrolü) hariç, plakadaki her bir oyuğa 50 μl alikot edin. A1-A6, yalnızca PV kontrolü olarak hizmet edecektir.
9. Kuyu duvarlarında virüs kalmadığından emin olmak için plakayı 500 rpm'de 1 dakika santrifüjleyin.
10. Plakaları 37 °C'de 1 saat boyunca %5 karbondioksit (CO₂) inkübe edin ve serumun SARS-CoV-2 glikoproteinini bağlaması için zaman tanıyın.
11. Anjiyotensin dönüştürücü enzim 293 (ACE17) ekspresyon plazmidi ve transmembran serin proteaz 2 (TMPRSS2) ekspresyon plazmidleri ile transfekte edilmiş HEK 24T/24 hedef hücrelerinden oluşan bir plaka hazırlayın.
    1. Kültür ortamını plakadan çıkarın.
    2. Hücre ayrılmasını ve atılmasını önlemek için tabağın bir tarafında 2 ml PBS ile plakayı iki kez yıkayın.
    3. Plakaya 2 ml tripsin ekleyin ve hücreler ayrılana kadar plakayı inkübatöre koyun.
    4. Hücreler ayrıldıktan sonra, tripsin aktivitesini söndürmek ve hücreleri nazikçe yeniden süspanse etmek için plakaya 6 ml DMEM /% 10 FBS /% 1 penisilin / streptomisin ekleyin.
    5. TC20^TM Otomatik Hücre Sayacı veya sayma odası sürgüsü kullanarak hücreleri sayın ve her bir oyuğa toplam 50 μl hacminde 1 x^{10 4} hücre ekleyin.
12. Plakayı 48-72 saat, 37 ° C'de,% 5 CO₂ inkübe edin.
Kültür
13. ortamını tüm kuyucuklardan çıkararak ve 25 μl 1: 1 PBS karışımı ekleyerek bir GloMax® Navigator Mikroplaka Luminometre üzerinde Bright Glo TM lusiferaz test sistemini kullanarak plakayı okuyun: Bright Glo^TM lusiferaz tahlil reaktifi.
14. Luminometre tarafından sağlanan ham verilerden, yerleşik protokolleri kullanarak yarı maksimal inhibitör konsantrasyonu (IC50) nötralize edici antikor titrelerini hesaplayın. 1:40 seyreltmenin altındaki IC50 değerleri negatif olarak kabul edilir. Veriler alternatif olarak AutoPlate kullanılarak da değerlendirilebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
MultiGuard Bariyerli pipet uçları 1-20 μl	Sorenson Biyobilim	30550T
MultiGuard Bariyerli pipet uçları 1-200 μl	Sorenson Biyobilim	30550T
NuncTM Hücre Kültürü Kabı Delta Yüzey İşlemli (10 cm steril tabaklar)	Thermo Fisher Bilimsel	150350
Pipet leğenleri (50 ml)	jenerik
96 oyuklu beyaz tabak	Termo BalıkçıBilimsel	136101
HEK 293T/17 hücreli	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-11268
Konak hücre giriş reseptörü anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (ACE2) ekspresyonu plazmit: pCDNA3.1 + -ACE2			Simmons 2004
Coronavirus Spike (S) protein hazırlama transmembran serin proteaz 2 (TMPRSS2) ekspresyon plazmi: pCAGGS-TMPRSS2			Bertram 2010
Dulbecco'nun %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin (P/S) ile desteklenmiş 4.5 g/L Glikoz içeren modifiye Eagle ortamı (DMEM)	Pan-Biyoteknoloji	P04-04510 P40-37500 P06-07100
FuGENE® HD Transfeksiyon Reaktifi, 1ml	Promega	E2311
Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı	Pan-Biyoteknoloji	P10-040100
SARS-CoV-2 PV'yi nötralize edebilen pozitif kontrol antikoru (Anti-SARS-CoV-2 Ab için Araştırma Reaktifi) (NIBSC, kod: 20/162, uluslararası olarak mevcuttur veya HICC-havuz 2/HICC havuz 3)
Test edilecek COVID-19 insan nekahet plazması
Parlak Glo lusiferaz test sistemi	Promega	E2650

Serisi · Serisi Fuar Serisi Serisi Fuar Serisi