Bir fare serumunda bir test aşısına karşı immünoglobulin G seviyelerinin ölçülmesi

Özet

Kaynak: Zeng, X. ve ark., Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) Enfeksiyonuna Karşı Bir Nanoemülsiyon Adjuvan Aşısının İmmün Tepkisinin Değerlendirilmesi.J. Vis. Uzm.(2023)

Bu video, önceden aşılanmış farelerde yeni bir nanoemülsiyon adjuvan aşısına karşı antikor bağışıklık tepkisini değerlendirmek için bir yöntemi göstermektedir. Bağışıklama, IgG antikor titrelerinin belirlenmesiyle doğrulandığı gibi antikor yanıtını arttırır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. MRSA HI antijen proteininin hazırlanması

1. Ticari kaynaklardan Fe iyon yüzey belirleyici faktör B (IsdB) ve α-hemolizin mutant (Hla) klonları elde edin (bkz. Malzeme Tablosu), IsdB ve Hla genlerini amplifiye etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu gerçekleştirin ve ürünlerini PGEX-6P-2 plazmidine bağlayın (ticari olarak elde edilir; bkz. Malzeme Tablosu). Escherichia coli'nin vektör Xl / mavi suşu ile ekran.
2. Pozitif klonu E. coli BL21 yetkin hücrelere dönüştürün (Malzeme Tablosuna bakınız) ve köpekbalığı kültürü ile çoğaltın.
3. Antijeni eksprese edin ve indüksiyondan sonra izopropil-β-D-1-merkaptogalaktopiranosid ve multimodal kromatografi (MMC) izolat kitleri ile izole edin (bkz. Malzeme Tablosu).
4. Antijen proteinini karakterize edin ve tam otomatik bir temizleyici ile saflaştırın.
   1. Ticari olarak temin edilebilen bir afinite kromatografi reçinesi kullanılarak berraklaştırılmış lizatlardan afinite saflaştırılan gutatyon S-transferaz (GST) etiketli proteinler (bkz. Malzeme Tablosu).
   2. Rekombinant proteinleri izopropil-β-D-1-merkaptogalaktopiranosid ve multimodal kromatografi (MMC) ile saflaştırın.
   3. Triton X-114 faz ayırma yöntemi ile endotoksini çıkarın. Kısaca, homojen bir çözelti elde etmek için% 1 Triton X-114'ü 0 ° C'de 5 dakika boyunca rekombinant protein elüat ile karıştırın ve iki fazın oluşmasına izin vermek için 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
5. Endotoksin konsantrasyonunu tespit etmek için Kaplumbağa kitleri ile bakteriyel endotoksin test yöntemini kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). Protein antijeni için endotoksin, uluslararası standarttan (1.5 EU/μg) daha düşük olan 0.06 EU/μg'dir.
   1. Test ürününün endotoksin tespiti üzerindeki olası etkisini ortadan kaldırmak için bir girişim testi yapın.
      not: Çin farmakopesi Ek 2020'ye göre, endotoksin içeriği 5 EU/dozdan az olmalıdır. Limulus lizatının duyarlılığı (λ0.25 EU/mL) ve 33.3'lük maksimum etkili seyreltme oranı, maksimum geçerli seyreltmeye dayalı olarak hesaplandı, MVD = cL/λ, burada L, test makalesi için bakteriyel endotoksinin sınır değeridir, c, test makalesi çözeltisinin konsantrasyonudur ve L, EU/m olarak ifade edildiğinde, c, 1.0 mg / mL'ye eşittir. λ, jel yöntemindeki at nalı yengeç reaktifinin etiketli duyarlılığıdır (EU/mL).
6. Antijeni (48 kDa, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi [SDS-PAGE] ile belirlenir) endotoksin veya fosfat tamponlu salin (PBS) içermeyen steril suda 1.5 mg / mL'de yeniden birleştirin (sodyum diklorat yöntemi).
   NOT:
   
   
   

1. 
   
2. 
   

5. 7. 
      
   16. 
       

1. 
   
2. 
   

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
5424-Küçük yüksek hızlı santrifüjFA-45-24-11	Eppendorf, Almanya	5424000495
96 oyuklu plakalar	Corning Incorporated, ABD	CLS3922
AFM Boyutu Hızlı Tarama	BRUKER, Almanya	sıfır
Balb/c fareleri	Pekin HFK Biyobilim Co., Ltd.
BCIP/NBT	Fuzhou Maixin Biyoteknoloji Geliştirme Şirketi, Çin	BCIP/NBT
Bio-Rad 6.0 mikroplaka okuyucu	Bio-Rad Laboratuvarları Limited Şirketi, CA, ABD	sıfır
BL21 Yetkili Hücre	Merck kırlangıç, Almanya	70232-3CN
BSA-100G	Sigma-Aldrich, Amerika Birleşik Devletleri	B2064-100G
Santrifüj 5810 R	Eppendorf, Almanya	5811000398
Coomassie parlak mavi G-250 boyama solüsyonu	MIKX, Çin	DB236
Renk giderme çözümü	BOSTER, Çin	AR0163-2
Elektro ısıtma duran sıcaklık kültivatörü HH-B11-420	Şangay Yuejin Tıbbi Cihaz Fabrikası, Çin	sıfır
Elektroforez aparatı	Pekin Liuyi Enstrüman Fabrikası, Çin	DYCZ-25D Serisi
Jel görüntüsü	Tanon, Amerika Birleşik Devletleri	sıfır
Glutatyon-Sefaroz Reçine GST	Mei5bio, Çin	afinite kromatografi reçinesi
H2SO4	Chengdu KESHI Chemical Co., LTD, Çin	7664-93-9
HI rekombinant protein	Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi, Çin	110-27-0
HRP -Keçi Anti-Fare IgG	Biodragon, Çin	BF03001
HRP- Keçi anti-fare IgG1	Biodragon, Çin	BF03002R
HRP- Keçi anti-fare IgG2a	Biodragon, Çin	BF03003R
HRP- Keçi anti-fare IgG2b	Biodragon, Çin	BF03004R
Aşılama döngüsü	Haimen Feiyue Co, LTD, Çin	YR-JZH-1UL
IsdB ve Hla klonları	Şangay Jereh Biyoteknoloji A.Ş., Çin	sıfır
İzopropil hindistan cevizi (farmasötik adjuvan)	SEPPIC, Fransa	sıfır
izopropil-β-D-1-merkaptogalaktopiranosid	fdbio, Çin	FD3278-1
LB bulyon kültür ortamı	Pekin AOBOX Biyoteknoloji A.Ş., LTD, Çin	02-136
Düşük sıcaklıkta soğutmalı santrifüj	Eppendorf, Almanya	sıfır
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., Birleşik Krallık	sıfır
Mikro plaka yıkama makinesi 405 LSRS	Bio Tek Instruments, Inc Yayla Parkı, ABD	sıfır
Mini-TBC Kompakt Film Transfer Cihazı	BeiJingDongFangRuiLi Co., LTD, Çin	1658030
MMC paketleme	TOSOH (ŞANGAY) CO., LTD	22818
MRSA252	Amerika Birleşik Devletleri, ATCC	sıfır
Nanodrop ultraviyole spektrofotometre	Termo Bilimsel, ABD	sıfır
Yeni FlashTM Protein herhangi bir KD PAGE Protein elektroforezi jel kiti	DAKEWE, Çin	8012011
Pbs	biosharp, Çin	sıfır
PCR, Amplifikatör	Termal Döngüleyici, ABD	sıfır
pGEX-hedef gen rekombinant plazmit	Şangay Jereh Biyoteknoloji A.Ş., Çin	B3528G
Fosfotungstik asit	G-CLONE, Çin	CS1231-25g
Pipet	Eppendorf, Almanya	3120000844
Polioksietillenmiş hint yağı (farmasötik adjuvan)	Aladdin, Çin	K400327-1kg
Birincil antikor	Laboratuvar ev yapımı: pozitif serumlu aşılanmış farelerden	sıfır	Ayrıntılar için Referans 11'e bakın
Propilen glikol (farmasötik adjuvan)	Sigma-Aldrich, Amerika Birleşik Devletleri	P4347-500ML
Protein İşaretleyici	Thermo Scientufuc, Amerika Birleşik Devletleri	26616
PVDF Transfer Membranı	Invitrogen, Amerika Birleşik Devletleri	88518
Taramalı Elektron Mikroskobu	JEOL, Japonya	JSM-IT800
Talos L120C TEM	Thermo Fisher, Amerika Birleşik Devletleri	sıfır
TMB renk çözümü	TIAN GEN, Çin	PA107-01
Kaplumbağa kitleri	Xiamen Bioendo Teknoloji A.Ş., LTD	ES80545
Ara-20	Macklin, Çin	9005-64-5

Serisi Serisi Serisi arası Serisi Serisi Serisi