>1. İnfluenza A virüsü, IAV ile enfekte olmuş hücrelerde proteinlerin kaspazlarla bölünmesinin veya bozulmasının değerlendirilmesi
- 12 oyuklu hücre kültürü plakasında oyuk başına 3 x 10,5 Madin-Darby Köpek Böbreği (MDCK) veya A549 hücresi tohumlayın.
not: MDCK hücreleri kullanılıyorsa, ilgilenilen proteine karşı antikorun köpek türünü tanıdığından emin olun.
- Kuyucukları çiftler halinde tohumlayın, yani bir kontrol çifti-enfekte olmamış sahte numune için bir kuyu ve enfekte-sahte numune için bir kuyu, enfekte olmamış inhibitör A numunesi için bir test çifti-bir kuyu ve enfekte-inhibitör A numunesi için bir tane. Her ek inhibitör ile çift sayısını artırın.
- Hücreleri gece boyunca %5 CO2 atmosferi altında 37 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, hücreleri IAV (bir H1N1 alt tipi veya başka bir alt tip) ile enfekte edin.
- Bunun için, virüs stoğunu 400 μL serumsuz minimum esansiyel ortam (MEM) içinde seyrelterek hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) 0.5-3.0 plak oluşturan birim (pfu) / hücre (MOI hesaplanırken hücre sayısının iki katına çıkan bir faktör) çok sayıda enfeksiyonda (MOI) (MOI hesaplanırken hücre sayısının iki katına çıkan bir faktör).
not: MDCK hücrelerini enfekte etmek için, virüs aşısını 1 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyonda tosil fenilalanil klorometil keton (TPCK) -tripsin ile destekleyin.
- Eski kültür ortamını hücrelerden çıkarın (adım 1.3) ve hücreleri 1 mL / kuyu serum içermeyen MEM 2x ile yıkayın.
- Hücrelere 400 μL virüs aşısı (adım 1.4.1) ekleyin ve %5 karbondioksit (CO2) atmosferi altında 35 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- Bu arada, bir kaspaz inhibitörü (ör., Z-DEVD-FMK), bir lizozom İnhibitörü (ör., amonyum klorür, NH4Cl) veya bir proteazom inhibitörü (ör., MG132) (bkz. Malzeme Tablosu) serumsuz MEM'de sırasıyla 40 μM, 20 mM veya 10 μM'lik bir nihai konsantrasyonda (bkz.). Son iki inhibitör bir kontrol görevi görür. İnhibitörlerden birini serum içermeyen ortamda sahte olarak yeniden oluşturmak için kullanılan eşit miktarda çözücüyü (su dışındaysa) seyreltin.
- Virüs aşısını çıkarın ve hücreleri adım 1.5'te (1x) olduğu gibi yıkayın.
- Serum içermeyen MEM, 1 mL / kuyu, sahte veya bir inhibitör ile desteklenmiş, hücrelere ekleyin ve hücreleri adım 1.6'daki gibi inkübe edin. Bu zaman noktası 0 h enfeksiyonu olarak kabul edilir.
- 24 saat sonra, hücreleri 1 mL'lik bir şırınga pistonu (kauçuk taraf) ile kazıyarak hasat edin ve 1.5 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın.
- Tüpü oda sıcaklığında 1-2 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipet kullanarak toplayın.
not: Bu süpernatant, salınan virüs soyunun titresini ölçmek için bir plak tahlili için atılabilir veya kullanılabilir.
- Hücre peletini 250 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile adım 1.11'deki gibi yeniden santrifüjleme ile yıkayın.
- Süpernatanı çıkarın ve 80-100 μL hücre lizis tamponu (50 mM Tris (hidroksimetil) aminometan (THAM) hidroklorür (Tris-HCl), pH 7.4, 150 mM sodyum klorür (NaCl), %0.5 sodyum dodesil sülfat (SDS), %0.5 sodyum deoksikolat, %1 Triton X-100 ve 1x proteaz inhibitör kokteyli, bkz.
- Tüpü 98 ° C'de 10 dakika ısıtın, böylece toplam hücre lizatını tamamen parçalayın ve hazırlayın. Ertesi gün 1.15-1.17 adımlarını gerçekleştirmek için lizatları 4 °C'de saklayın, ancak en iyi sonuçlar için bu adımları aynı gün bitirin.
- Bir bikinkoninik asit (BCA) tablo test kiti kullanarak her numunedeki protein miktarını tahmin edin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Moleküler ağırlık belirteçleri ile birlikte standart SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile enfekte olmamış ve enfekte olmuş numunelerden eşit miktarda proteini çözün.
- Proteini bir nitroselüloz veya poliviniliden diflorür (PVDF) membranına aktarın (Malzeme Tablosuna bakınız).
not: PVDF membranı, bazı batı leke görüntüleyicilerinde yüksek bir arka plan verebilir; Uyumluluğu kontrol edin.
- Başka bir yerde açıklanan yöntemi kullanarak ilgilenilen proteini tespit etmek için western blotlama yapın.
- Sahte muamele edilmiş ve inhibitör ile muamele edilmiş enfekte numune şeritlerindeki protein seviyelerini karşılaştırın.
not: Protein seviyesi, kaspaz inhibitörü ile tedavi edilen enfekte numune şeridinde geri kazanılmışsa, protein kaspazlar tarafından parçalanır veya bozunur. Aksi takdirde, lizozom veya proteazom tarafından bozunur.
- Aynı deneyin en az üç tekrarından her şeritteki bant yoğunluğunu ölçerek ve karşılık gelen yükleme kontrol bandı ile normalleştirerek protein geri kazanımını ölçün.
- Batı lekelerini görüntülemek ve protein geri kazanımını ölçmek için herhangi bir çağdaş görüntüleyici ve ilgili yazılımı (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın.
