1. Antimikrobiyal Aktivitenin Değerlendirilmesi
>NOT: Bakteri içeren tüm çalışmalar, tahlilin veya laboratuvarın kontaminasyonunu önlemek için steril koşullar altında yapılmalıdır. Tüm ortamlar kullanılmadan önce otoklavlanmalı ve plastik eşyalar ve pipet gibi ekipmanlar steril tutulmalıdır. Çalışmanın bir biyolojik muhafaza başlığında (tip 2) yapılması tavsiye edilir.
- Antibiyotik iskelesi için uygun bakteri suşlarının gliserol stoklarını lizojeni et suyu agar (LB, üreticinin talimatlarına göre hazırlanır) üzerine çekin ve gece boyunca 37 °C.
'de büyütün
not: Antibakteriyel aktiviteyi test etmek için bakteri seçimi, kullanılan antibiyotik iskelesine göre yapılmalıdır. Laboratuvarın lojistik yetenekleri göz önünde bulundurularak, antibiyotiğe duyarlı olduğu bilinen türlerden 5-10 bakteriden oluşan temsili bir aralık seçilmelidir. Mümkünse dirençli bakteriler de test edilmelidir. Aşağıda verilen protokol çoğu bakteri üzerinde çalışacaktır, ancak özel koşulların gerekli olup olmadığını kontrol edin (örneğin, CO2, özel ortam) ve gerektiğinde değişiklikler yapın. Bu koşullar kullanılarak başarılı bir şekilde test edilen bakteriler arasında Staphylococci, Streptococci, Bacilli, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ve Enterococcus faecium bulunur.
- Plakadan tek bir koloni seçin ve gece boyunca 37 ° C'de 5 mL katyon ayarlı Mueller-Hinton Suyu (CAMHB, üreticinin talimatlarına göre hazırlanır) içinde kültürleyin.
- Gece boyunca kültürleri CAMHB'de ~ 40 kat seyreltin ve orta log fazına, 600 nm'de optik yoğunluğa (OD600) = 0.4-0.8, hacim 5 mL) kadar büyütün.
- Steril suda 1.28 mg / mL'de her bir floresan antibiyotiğin stok çözeltilerini hazırlayın ve 96 oyuklu bir plakanın ilk kolonuna 10 μL antibiyotik pipetleyin.
- İlk sütuna 90 μL CAMHB ve diğer tüm kuyucuklara 50 μL ekleyin. Ardından, plaka boyunca seri 2 kat seyreltme yapın.
- İyice karıştırın, ardından orta log faz kültürlerini ~ 106 koloni oluşturan birim (CFU) / mL'ye seyreltin ve ~ 5 x 105 CFU / mL'lik bir nihai konsantrasyon sağlamak için tüm kuyucuklara 50 μL ekleyin.
kültür hacmi (mL) = (mL cinsinden ortam hacmi)/(OD600 x 1.000)
örneğin, 12 mL'lik istenen bir ortam hacminde bir OD600 = 0.5 kültürü için, 12 mL ortama (12/(0.5 x 1.000) = 0.024 mL kültür ekleyin
- Plakaları kapaklarla kapatın ve sallamadan 37 °C'de 18-24 saat inkübe edin.
- Plakaları görsel olarak inceleyin, MIC gözle görülür bir büyüme olmadan en düşük konsantrasyon kuyusudur.
not: Aktif ve inaktif floresan antibiyotiklerin bazı örnekleri için Tablo 1'e bakınız.
2. Spektrofotometri ile Prob Birikiminin Analizi
>NOT: Bu santrifüjleme süreleri E. coli için optimize edilmiştir, bu nedenle diğer türler için küçük değişiklikler gerekebilir. NBD etiketli siprofloksasin probu için prob birikimi için temsili veriler rapor edilir.
- Bakteri suşlarının gliserol stoklarını LB agar üzerine dökün ve gece boyunca 37 °C'de büyür.
- Plakadan tek bir koloni seçin ve gece boyunca LB'de 37 °C'de kültürleyin.
- Gece boyunca kültürleri ortamda ~ 50 kat seyreltin ve orta log fazına kadar büyütün (OD600 = 0.4-0.8).
- Kültürleri 25 dakika boyunca 1.470 x g'da santrifüjleyin ve ortamı boşaltın.
- Bakterileri 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin, ardından 15 dakika boyunca 1.470 x g'da santrifüjleyin.
- Ortamı boşaltın ve yıkanmış peletleri PBS'de son OD600 = 2'ye yeniden süspanse edin.
- İstenirse, 1 mL bakteriye (nihai konsantrasyon 100 μM) 10.1 μL karbonil siyanür 3-klorofenilhidraz (CCCP, PBS'de 10 mM) ekleyin ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
not: CCCP bir akış pompası inhibitörüdür. CCCP'nin eklenmesi, akıntının etkisinin incelenmesine izin verecektir.
- Kültürleri 18.000 x g'da 20 ° C'de 4 dakika santrifüjleyin ve ortamı boşaltın.
- Pelete 1 mL floresan antibiyotik çözeltisi (PBS'de 10-100 μM) ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Kültürleri 18.000 x g'da 4 ° C'de 7 dakika santrifüjleyin ve ortamı boşaltın.
- Bakterileri 1 mL soğuk PBS'de tekrar süspanse edin ve adım 2.9'u tekrarlayın.
- Adım 2.10'u toplam 4 kez tekrarlayın.
- İstenirse, 180 μL lizis tamponu (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 2 mM sodyum EDTA) ve ardından 70 μL lizozim (H2O'da 72 mg / mL) ekleyerek bakterileri parçalayın.
- 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin, ardından 3 kez dondurun-çözdürün (5 dakika boyunca -78 ° C, ardından 15 dakika boyunca 34 ° C).
- Örnekleri 20 dakika boyunca sonikleştirin, ardından 30 dakika boyunca 65 ° C'ye ısıtın.
- Parçalanmış numuneleri (18.000 x g, 8 dakika) santrifüjleyin, ardından 10 kDa'lık bir filtre membranından süzün.
- Filtreyi 4x 100 μL su ile yıkayın.
- Lizatı düz tabanlı siyah 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve florofor için uygun uyarma ve emisyon dalga boylarına sahip bir plaka okuyucuda floresan yoğunluğunu ölçün (yani, 7- (dimetilamino) -2-okso-2H-krom-4-il [DMACA]: λex = 400 nm, λem = 490 nm; nitrobenzoksadiazol [NBD]: λex = 475 nm, λem = 545 nm).
not: Floresan NBD etiketli siprofloksasin antibiyotik kullanılarak bakterilerin spektrofotometrik analizlerinin örnekleri için Şekil 1'e bakınız.
