$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>1. Adoptif Hücresel Tedavi ile değişmez doğal öldürücü T hücrelerinin (iNKT Hücreleri) elde edilmesi
- iNKT hücrelerinin yönlü indüksiyonu
- Normal farelere intraperitoneal olarak α-Galactosylceramide (α-GalCer) (0.1 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte edin.
- iNKT hücrelerinin izolasyonu
- Modellemeden üç gün sonra, anestezitizasyon için farelere intraperitoneal olarak %1 sodyum pentobarbital (50 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte edin. Yeterince anestezi uygulanmış fareler, ayak parmağı tutamına arka pençe çekme tepkisi göstermez.
- Bir DBA / 1 farenin dalağını α-GalCer ile intraperitoneal olarak enjekte ettikten sonra izole edin. Dalağı 200 gözenekli bir elekte kesip öğüterek tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın.
- Hücre süspansiyonunu fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın, 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Yinelemek.
- Hücreleri 1 mL tam kan ve doku seyreltme solüsyonu ile yeniden süspanse edin. 3 mL fare lenfosit ayırma ortamı ekleyin, ardından hücreleri oda sıcaklığında 300 x g'da 20 dakika santrifüjleyin.
- Süt beyazı lenfosit tabakasını (yani üstten ikinci tabakayı) toplayın, PBS ile 2 kez yıkayın ve otomatik bir hücre sayacı ile sayın.
- iNKT hücrelerinin saflaştırılması için manyetik aktif hücre sıralama (MACS) pozitif seçim stratejisi
not: CD1d tetramerlerinin ön muamelesi için, 1 mg / mL α-Galcer,% 0.5 Tween-20 ve% 0.9 NaCl ile 200 μg / mL'ye seyreltildi ve elde edilen çözeltinin 5 μL'si 100 μL CD1d tetramer çözeltisine eklendi. Karışım oda sıcaklığında 12 saat inkübe edildi ve kullanım için 4 °C'ye yerleştirildi. T hücre reseptörü (TCR) β, deiyonize su ile 80 kat seyreltildi. Diğer tüm antikorlar stok çözelti olarak kullanıldı.
- 100 μL 4 °C PBS ile 107 hücreyi yeniden süspanse edin, 10 μL α-GalCer yüklü CD1d Tetramer-fikoeritrin (CD1d Tetramer-PE) ekleyin ve karanlıkta 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Hücreleri 2x PBS ile yıkayın ve 80 μL PBS'de tekrar süspanse edin.
- 20 μL anti-PE-MicroBeads ekleyin ve karanlıkta 20 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Bunları PBS ile 2 kez yıkayın ve hücreleri 500 μL PBS ile yeniden süspanse edin.
- Sıralama sütununu MACS sıralayıcının manyetik alanına yerleştirin ve 500 μL PBS ile durulayın.
- Adım 1.3.4'teki hücre süspansiyonunu sıralama sütununa ekleyin, akışı toplayın ve 3x'i PBS tamponu ile durulayın.
- Manyetik alanı çıkarın ve hücreleri sıralama sütunundan toplayın. Bu noktada, sıralama kolonuna 1 mL PBS tamponu ekleyin ve etiketli hücreleri toplama tüpüne sürmek ve saflaştırılmış iNKT hücreleri elde etmek için pistonu hızlı bir şekilde sabit bir basınçta itin. Otomatik hücre sayacı ile sayın.