Katyonik Polimer Kullanılarak Doğal Öldürücü Hücrelerde Viral Transdüksiyonun Arttırılması

Özet

Kaynak: Nanbakhsh, A., et al. Dextran, Murin ve İnsan Primer NK Hücrelerinin Lentiviral Transdüksiyon Verimliliğini Artırır. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, doğal öldürücü (NK) hücrelerde katyonik polimer aracılı viral transdüksiyon için bir testi göstermektedir. Hücreler, bir floresan proteini kodlayan transgenik lentivirüs vektörleri ile inkübe edilir. Katyonik bir polimerin eklenmesi, virüsün hücrelere bağlanmasını ve RNA'sını floresan proteini eksprese ederek konakçı genomuna entegre etmesini sağlar. Floresan, polimerin neden olduğu transdüksiyon artışını değerlendirmek için ölçülür.

Protokol

1. Murin ve insan primer NK hücrelerinin lentivirüs ile transdüksiyonu

1. 5, 10 × 20 enfeksiyon çokluğunda yeşil floresan proteini (GFP) lentivirüs süpernatanı varlığında ve Pb (8 μg / mL), PS (8 μg / mL) veya dekstran (8 μg / mL) varlığında 5 5 / mL ortamda 5 5 / mL ortamda 24 oyuklu bir plakada fare veya insan birincil NK hücrelerini askıya alın.
2. Plakaları 1.000 × g'da 60 dakika santrifüjleyin.
3. Süpernatanı boşaltmadan, hücreleri gece boyunca (16-18 saat)% 5.2 CO₂ ile aşılanmış 37 ° C'lik bir inkübatörde kültürleyin.
4. 10 mL PBS ile yıkayın ve interlökin 2 (IL-2, 300 U / mL) varlığında 2 mL tam Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 kültür ortamında yeniden süspanse edin.
5. Şişelere hafifçe vurarak 7. günde dönüştürülmüş NK hücrelerini hasat edin.
   1. Hasat edilen hücreleri, 96 oyuklu, yüksek protein emici polistiren plakaları gece boyunca 2,5 μg/mL konsantrasyonlarda anti-NKG2D mAb ile kaplayarak, plakaya bağlı anti-doğal öldürücü grup 2D (NKG2D) (A10) mAb'nin titre edilmiş konsantrasyonları ile aktive edin.
   2. Birincil NK hücrelerinin eklenmesinden önce her bir kuyuyu 100 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkayın.
6. İnterferon-gama (IFN-γ) gibi sitokinleri ölçmek için aktivasyondan 16 ila 18 saat sonra çok kanallı bir pipet kullanarak kültür süpernatantlarını toplayın. Enzime bağlı immünosorbent test (ELISA) kitleri ile sağlanan rekombinant sitokinleri kullanarak standart eğriler oluşturun.
7. Annexin-V/7-amino-aktinomisin D (7-AAD) boyaması kullanarak NK hücresi canlılığını test edin ve bir akış sitometresi kullanarak dönüştürülmüş NK hücreleri arasındaki nekrotik hücrelerin yüzdesini belirleyin.
   1. Bu testi gerçekleştirmek için, murin ve insan NK hücrelerini transdüksiyondan dört gün sonra hasat edin, her biri 5 dakika boyunca 500 × g'da 10 mL soğuk PBS ile iki kez yıkayın ve bir Annexin-V (PE) / 7-AAD kiti ile inkübe edin.
8. Verileri analiz etmek için uygun akış sitometrisi yazılımı kullanın. Canlı hücre popülasyonunu seçin ve viral transdüksiyonun bir ölçüsü olarak GFP'nin (floresein izotiyosiyanat [FITC] kanalı) ekspresyonunu analiz edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dekstran	Sigma-Aldrich	90-64-91-9
Polibren (Pb)	Sigma-Aldrich	TR-1003
Protamin sülfat (PS)	Sigma-Aldrich	P3369 Serisi
RPMI1640	Corning	10-040-Özgeçmiş
İnterferon gama (IFN-γ )	eBiyobilim	14-7311-85
Propidium lodür boyama çözeltisi	Bd	51-66211E
Lipofektamin 3000	Termo Balıkçı	L3000015
İzofluran	Anka	NDC 57319-559-05
293T hücreler	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-3216
T75 şişeleri	Corning	430641U
ELISA kitleri	Ebiyobilim	00-4201-56