Primer Makrofajların Modifiye mRNA ile Transfekte Edilmesi

Özet

Kaynak: Herb, M. et al., Primer Makrofajların In Vitro Transkribe mRNA ile Yüksek Verimli Transfeksiyonu. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, yeşil floresan proteini kodlayan modifiye mRNA ile birincil makrofajların transfekte edilmesi sürecini göstermektedir. İmmünojenisiteyi azaltmak ve stabilitesini artırmak için tasarlanan bu modifiye mRNA'lar, floresan mikroskobu ile doğrulanan yeşil floresan proteinlerin başarılı bir şekilde transfeksiyonunu ve ardından ekspresyonunu sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

>NOT: Tüm adımları eldiven giyerek gerçekleştirin. Hücrelerin kontaminasyonunu önlemek için tüm transfeksiyon adımlarını laminer bir akış başlığı altında gerçekleştirin. mRNA ile çalışmadan önce, pipetler gibi tüm aletleri ve her yüzeyi %70 etanol ve/veya RNAse bozunduran bir yüzey aktif madde ile temizleyin (Malzeme Tablosu). Tüm reaksiyon tüplerinin RNAse içermeyen ve steril olduğundan emin olun. Seyreltmeler için sadece steril, RNAaz içermeyen su kullanın. Yalnızca filtreli pipet uçları kullanın. Her pipetleme adımından sonra pipet uçlarını değiştirin.

1. DNA Şablonunun Oluşturulması

NOT: Bu protokolü kullanan in vitro mRNA transkripsiyonu için DNA şablonu, RNA polimerazın yerleştirilmesine izin vermek için bir T7 promotor dizisi içermelidir. İlgilenilen proteinin DNA dizisini içeren plazmit, ilgilenilen dizinin hemen yukarısında doğru yönlendirilmiş bir T7 promotor dizisi içeriyorsa, plazmitin doğrusallaştırılmasının (bkz. adım 1.1.) gerçekleştirilmesi gerekir. Aksi takdirde, polimeraz zincir reaksiyonu ile ilgilenilen diziye bir T7 promotor ekleyin (PCR, bkz. adım 1.2.).

1. T7 promotor içeren plazmitlerin doğrusallaştırılması
   1. Halihazırda doğru yönlendirilmiş bir T7 promotor dizisi içeren plazmitleri, ilgilenilen dizinin durdurma kodonunun aşağı akışını kesen bir kısıtlama enzimi ile sindirim yoluyla doğrusallaştırın. Aksi takdirde, ilgilenilen diziden sonra transkripsiyon düzgün bir şekilde sona ermeyecektir.
      NOT: Künt uçlar veya 5' çıkıntılar bırakan kısıtlama enzimlerini kullanmak en iyisidir.
   2. Sindirilmemiş ve sindirilmiş plazmit DNA'nın agaroz jel elektroforezi ile plazmidin tam doğrusallaştırılmasını onaylayın.
   3. Bir DNA saflaştırma kiti (Malzeme Tablosu) kullanarak in vitro mRNA transkripsiyonu için bir DNA şablonu olarak kullanmadan önce doğrusallaştırılmış plazmit DNA'yı saflaştırın.
2. T7 promotor'un PCR ile bağlanması
   1. Aşağıdaki bileşenleri içeren bir ileri astar kullanın (belirtilen sırayla 5' ila 3' arasında): promotorun yaklaşık 5 rastgele bp yukarı akışı (örneğin, GAAAT); T7 promotor dizisi (TAATACGACTCACTATAG); artan transkripsiyon verimliliği (GG) için iki ekstra G; başlangıç kodonunu çevreleyen plazmit dizisine homolog olan hedef diziye özgü kısım.
      not: KOZAK dizisinin 3-6 bp yukarı akışında ve başlangıç kodonundan, KOZAK dizisi ve başlangıç kodonundan (genellikle GCCACC ATG G), başlangıç kodonunun 12-18 bp aşağısından oluşmalıdır. İlgilenilen dizi halihazırda bir KOZAK dizisi veya başlangıç kodonu içermiyorsa, bunlar bu adımda basitçe astar dizisine dahil edilerek eklenebilir.
   2. İleri astarın t_m'sini yalnızca hedef diziye homolog parçayı dikkate alarak hesaplayın.
   3. Dimer/firkete oluşumunu değerlendirmek için, 50 bp'yi kolayca aşabilen tüm astar dizisini kullanın.
   4. Durdurma kodonunun akış aşağısında bir yerde bulunan bir ters astar kullanın.
      NOT: İlgilenilen dizi halihazırda bir durdurma kodonu içermiyorsa, bu adımda basitçe astar dizisine dahil edilerek eklenebilir.
   5. Düzeltme okumalı yüksek kaliteli bir polimeraz kullanarak bir PCR gerçekleştirmek için ileri ve geri primerleri kullanın (Malzeme Tablosu).
   6. Agaroz jel elektroforezi ile tek bir ürünün oluşturulduğunu ve amplikon boyutunu onaylayın (örneğin, %1 agaroz jel ve 100 V sabit akım kullanın).
   7. Bir DNA saflaştırma kiti kullanarak in vitro haberci ribonükleik asit (mRNA) transkripsiyonu için deoksiribonükleik asit (DNA) şablonu olarak kullanmadan önce PCR ürününü saflaştırın.

2. mRNA Üretimi

1. İn vitro mRNA transkripsiyon kitinin tüm bileşenlerini çözün (Malzeme Tablosuna bakınız). 5 saniye girdap yapın ve 2.000 x g'da 2 saniye aşağı döndürün. Kullanana kadar buz üzerinde tutun.
2. Reaksiyon karışımını in vitro mRNA transkripsiyonu için 0.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde aşağıdaki sırayla hazırlayın (toplam hacim 40 μL): 20 μL 10x anti-ters kapaklı analoglar/nükleosit trifosfat (ARCA/NTP) karışımı (in vitro mRNA transkripsiyon kitine dahildir); 0.25 μL 5-metil-sitidin trifosfat (5-mCTP) (nihai konsantrasyon (fc) 1.25 mM'dir; toplam CTP'nin% 50'si); 0.25 μL psödo-üridin trifosfat (yalancı UTP) (fc 1.25'tir) Mm; Toplam UTP'nin %50'si); X μL DNA şablonu; 2 μL T7 RNA polimeraz karışımı (in vitro mRNA transkripsiyon kitine dahildir); Y μL RNAse-free H₂O.
   NOT: X, en az 1 μg DNA içeren bir hacimdir. Örneğin, 625 ng/μL'lik bir stok çözeltisinden 1,6 μL. Y, toplam 40 μL'lik hacmin yedek hacmidir.
3. 5 saniye girdap yapın ve 2.000 x g'da 2 saniye aşağı döndürün. İn vitro transkripsiyon için bir termal karıştırıcı üzerinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca 400 rpm'de inkübe edin.
4. Daha sonra, şablon DNA'nın çıkarılması için doğrudan reaksiyon karışımına 2 μL DNaz I ekleyin. 5 saniye girdap yapın ve 2.000 x g'da 2 saniye aşağı döndürün.
5. 37 °C'de 400 rpm'de 15 dakika bir termal karıştırıcı üzerinde inkübe edin. Kontrol jeli için 2 μL'lik bir alikot alın (adım 3.3) ve -80 °C'de saklayın.
6. Poli(A) kuyruğu için, aşağıdaki bileşenleri doğrudan önceki reaksiyon karışımına ekleyin (50 μL'lik bir nihai hacme kadar): 5 μL 10x poli(A) polimeraz reaksiyon tamponu ve 5 μL poli(A) polimeraz (her ikisi de in vitro mRNA transkripsiyon kitinde bulunur). 5 saniye girdap yapın ve 2.000 x g'da 2 saniye aşağı döndürün.
7. Karışımı 37 °C'de 30 dakika boyunca 400 rpm'de bir termomikser üzerinde inkübe edin. Kontrol jeli için 2 μL'lik bir alikot alın (adım 3.3) ve -80 °C'de saklayın.
8. mRNA'nın 5'-uçlarının fosforilasyonu için, aşağıdaki bileşenleri doğrudan önceki reaksiyon karışımına ekleyin (60 μL'lik bir nihai hacme kadar): 3 μL RNAz-free H₂O; 6 μL 10x Antarktika fosfataz reaksiyon tamponu; 3 μL Antarktika fosfataz (60 μL reaksiyon hacmi için 15 birim). 5 saniye girdap yapın ve 2.000 x g'da 2 saniye aşağı döndürün.
9. Karışımı 37 °C'de 30 dakika boyunca 400 rpm'de bir termal karıştırıcı üzerinde inkübe edin.
10. Antarktika fosfatazı 80 ° C'de 2 dakika boyunca inkübe ederek ısıyla
    not: İdeal olarak, ayrı bir termal karıştırıcı kullanın, ilk karıştırıcı istenen sıcaklığa ulaşana kadar beklemeyin.

3. mRNA Saflaştırma

1. Özel bir RNA saflaştırma kiti (Malzeme Tablosu) kullanarak in vitro kopyalanan mRNA'yı saflaştırın.
   1. Adım 2.10'dan itibaren mRNA reaksiyon karışımına X μL elüsyon çözeltisi ekleyin. 5 kez ters çevirerek karıştırın. 300 μL bağlayıcı çözelti konsantresi ekleyin. 5 kez nazikçe pipetleyerek karıştırın.
      NOT: X, toplam 100 μL'lik bir hacme kadar olan yedek hacimdir. Örneğin, 60 μL mRNA reaksiyon karışımına 40 μL elüsyon çözeltisi ekleyin.
   2. 100 μL RNAaz içermeyen etanol ekleyin. 5 kez nazikçe pipetleyerek karıştırın.
   3. Verilen toplama tüplerinden birine bir filtre sütunu yerleştirin. mRNA reaksiyon karışımını filtreye dokunmadan nazikçe filtrenin ortasına aktarın. Oda sıcaklığında (RT) 1 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin.
   4. Filtre kolonunu dikkatlice kaldırın ve toplama borusundaki akışı atın. Filtre sütununu aynı toplama tüpüne geri yerleştirin.
   5. 500 μL yıkama solüsyonu ekleyin (yıkama solüsyonunu ilk kez kullanmadan önce 20 mL RNAaz içermeyen etanol eklemeyi unutmayın).
   6. RT'de 1 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin. Bir kez daha yıkamak için 3.1.4-3.1.6 adımlarını tekrarlayın.
   7. Filtre kolonunda kalan sıvıyı çıkarmak için RT'de 1 dakika boyunca tam hızda (17.900 x g) santrifüjleyin. Filtre kolonunu toplama tüpünden dikkatlice alın. Filtre sütununu yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.
   8. Filtreye dokunmadan filtrenin ortasına 50 μL elüsyon tamponu ekleyin. Termal karıştırıcı üzerinde 65 °C'de 10 dakika inkübe edin.
   9. RT'de 1 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin. Filtre sütununu çıkarın ve atın.
2. Örneğin, 260 ve 280 nm'de absorbansı ölçmek için bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak ayrıştırılmış mRNA'nın konsantrasyonunu ve saflığını ölçün.
   NOT: 1.8-2.1'lik bir A260/A280 oranı, yüksek oranda saflaştırılmış mRNA'nın göstergesidir.
3. Denatüre etme koşulları altında agaroz jel elektroforezi ile adım 2.5 ve 2.7'deki alikotları analiz ederek tek bir ürünün, doğru transkript uzunluğunun ve poli(A) kuyruğunun varlığını doğrulayın (örneğin, 20 mM 3- (N-morfolino) propansülfonik asit [MOPS], 5 mM sodyum asetat, 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve %20 formaldehit içeren %1,2'lik bir agaroz jeli kullanın ve 20 mM MOPS'ta çalıştırın, 5 mM sodyum asetat, 1 mM EDTA ve 100 V sabit akımda %0,74 formaldehit).
4. Saflaştırılmış mRNA'yı transfeksiyona kadar -80 °C'de elüsyon tüpünde saklayın. Transfeksiyon için yalnızca düşük miktarlarda mRNA kullanılıyorsa, tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için mRNA'yı ayırın.
   NOT: mRNA -80 °C'de yaklaşık 1 yıl saklanabilir.

4. Makrofaj Hazırlama

1. C57 / BL6 farelerini (aynı cinsiyetten ve 6-24 haftalık fareleri kullanın) servikal çıkık ile ötenazi yapın.
   NOT: Aynı fareler, primer makrofajların (PM) izolasyonu (adım 4.2) ve BMDM üretimi (adım 4.3 ve 4.4) için kullanılabilir. PM'nin izolasyonu için en az iki fare kullanın. Yalnızca BMDM oluşturulacaksa, genellikle bir fare yeterlidir.
2. Peritoneal makrofajların immünomanyetik zenginleşmesi.
   1. 10 mL'lik bir şırıngayı 0,9 x 40 mm'lik bir kanülle 8 mL buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ve 2 mL hava ile doldurun. Periton boşluğunu PBS ile yıkayın. Hava, PBS'nin sızıntısını en aza indiren bir kabarcık oluşturacaktır.
   2. Aynı şırınga ile hızlı bir şekilde periton lavajı toplayın ve 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne aktarın. Gerekirse birden fazla farenin periton hücrelerini birleştirin. Hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun.
   3. Hücre süspansiyonunu 650 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve kırmızı kan hücrelerini parçalamak için hücre peletini 30 saniye boyunca 5 mL% 0.2 NaCl içinde yeniden süspanse edin.
   4. İzotonik koşulları yeniden oluşturmak için toplam 10 mL hacme 5 mL% 1.6 NaCl ekleyin. 650 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
   5. Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 periton lavajı başına 97.5 μL manyetik hücre sıralama (MCS) tamponunda (2 mM etilendiamintetraasetik asit [EDTA], PBS'de% 0.5 sığır serum albümini [BSA]) yeniden süspanse edin (ör., üç fare yıkandıysa, 292.5 μL'de yeniden süspansiyon).
   6. 97.5 μL hücre süspansiyonu başına CD11b'ye özgü bir antikora konjuge edilmiş 2.5 μL paramanyetik boncuk ekleyin (ör., 7.5 μL ila 292.5 μL ekleyin).
   7. Bir orbital çalkalayıcı üzerinde 15 rpm'de 15 dakika buz üzerinde inkübe edin.
   8. Hücre süspansiyonunu 650 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL MCS tamponunda yeniden süspanse edin.
   9. Toplam 5 mL hacme 4 mL MCS tamponu ekleyin ve hücreleri üç kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek yıkayın.
   10. Toplam üç yıkama adımı için 4.2.8 ve 4.2.9 adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
   11. Yıkama adımları sırasında, manyetik hücre ayırıcısına bir LS sütunu yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Kolonu 3 mL MCS tamponu ile durulayın.
       not: Sütunu tıkayabileceğinden herhangi bir baloncuktan kaçının.
   12. Hücre peletini 1 mL MCS tamponunda yeniden süspanse edin. Toplam 4 mL'lik bir hacme 3 mL MCS tamponu ekleyin ve üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
   13. 4 mL hücre süspansiyonunu durulanmış LS kolonuna aktarın.
       NOT: Yine, sütunu tıkayabileceğinden herhangi bir baloncuktan kaçının.
   14. Kolonun rezervuarı tamamen boşalana kadar bekleyin. Kolonun damlaması durana kadar ilave sıvı eklemeyin.
   15. Sütuna 3 mL MCS tamponu ekleyin. Ardından, sütunun rezervuarı tamamen boşalana kadar bekleyin. Adım 4.2.15'i iki kez daha tekrarlayın.
   16. LS kolonunu 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne yerleştirin. Kolona 5 mL MCS tamponu uygulayın. Kolondan 2 mL sıvı geçene kadar bekleyin, ardından kalan fraksiyonu yavaşça tüpe itmek için pistonu kullanın.
   17. Hücre süspansiyonunu 650 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
   18. Hücre peletini% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS) (DMEM + FCS) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamının (DMEM) 1 mL'sinde yeniden süspanse edin.
   19. Bir Neubauer sayım odasında tripan mavisi çözeltisinde ve DMEM + FCS'deki tohum hücrelerini kültür plakalarına sayarak canlı hücrelerin sayısını belirleyin.
       NOT: Düz tabanlı bir mikrotitre plakasında 100.000 hücre / kuyu yoğunluğunda PM tohumu. Doku kültürü ile muamele edilmiş plakları kullanmayın, çünkü PM bunlardan ayrılamaz. Bunun yerine işlem görmemiş plakalar kullanın.
3. BMDM'nin Üretilmesi
   1. Bir makas kullanarak arka bacaklardaki cildi ve kasları çıkarın. Her bacağı% 70 etanole kısa bir süre batırarak yıkayın.
   2. Bacakları ayırın ve uyluk kemiğinin ve kaval kemiğinin her iki ucunu makasla keserek açın.
   3. 0,6 mm x 30 mm'lik bir kanül ile doldurulmuş 5 mL'lik bir şırıngayı 5 mL çok düşük endotoksin (VLE) RPMI 1640 ile doldurun ve kemik iliğini açılan kemiklerden bir kültür kabına boşaltın.
   4. Gerekirse 4.3.1-4.3.3 adımlarını tekrarlayarak birden fazla farenin kemik iliğini birleştirin. Kemik iliğini 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne aktarın.
   5. Kemik iliği süspansiyonunu 650 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
   6. Hücre peletini 5 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponunda (% 8.3 amonyum klorür, NH₄Cl, 0.1 M Tris) yeniden süspanse edin ve kırmızı kan hücrelerini parçalamak için RT'de 5 dakika inkübe edin.
   7. Hücre süspansiyonunu 650 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
   8. %10 FCS, %1 penisilin / streptomisin, %1 HEPES, %1 sodyum piruvat ve 10 ng/mL rekombinant makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) (RPMI+++++) ile desteklenmiş 1 mL VLE Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 besiyerinde hücre peletini yeniden süspanse edin.
   9. Toplam 5 mL hacme 4 mL RPMI+++++ ekleyin.
   10. Her bir tabağa 7 mL RPMI+++++ orta pipetleyerek fare başına 5 adet 92 mm x 16 mm işlenmemiş Petri kabı hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
   11. 1 mL hücre çözeltisini hazırlanan 5 kültür kabına aktarın ve 37 ° C ve% 5 CO_2'de inkübe edin.
   12. 4 gün sonra, 4 mL RPMI+++++ ekleyerek hücreleri besleyin. 6-7 gün sonra, kemik iliği hücreleri tamamen BMDM'ye farklılaşır.
4. BMDM'nin hasat edilmesi
   1. Ortamı kültür kaplarından tamamen çıkarın. Her yemeğe PBS'de 5 mL ılık 0.2 mM EDTA ekleyin.
   2. BMDM'yi ayırmak için tüm plakayı bir hücre kazıyıcı ile nazikçe kazıyın. Hücre süspansiyonlarını 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpünde birleştirin.
   3. 5 bulaşığı da tekrar yıkayın. 5 yemeğin tümü için PBS'de aynı hacimde 5 mL ılık 0.2 mM EDTA kullanın. Bu hücre süspansiyonunu önceki adımdaki süspansiyonla birleştirin.
   4. Hücre süspansiyonunu 650 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
   5. Hücre peletini %10 FCS, %1 HEPES, %1 sodyum piruvat ve 10 ng/mL rekombinant M-CSF ile desteklenmiş ancak antibiyotik içermeyen (RPMI⁺⁺⁺⁺) 1 mL VLE RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin.
   6. Bir Neubauer sayım odasında tripan mavisi çözeltisinde ve tohum hücrelerini RPMI⁺⁺⁺⁺ cinsinden kültür plakalarına sayarak canlı hücrelerin sayısını belirleyin.
      not: Düz tabanlı bir mikrotitre plakasında maksimum 50.000 hücre / kuyu yoğunluğunda tohum BMDM'si. Doku kültürü ile tedavi edilen plakları kullanmayın, çünkü BMDM bunlardan zor ayrılabilir. Bunun yerine işlem görmemiş plakalar kullanın.

5. Makrofajların mRNA ile Transfeksiyonu

1. Gerekli mRNA transfeksiyon tamponu hacmini hesaplayın.
   not: Gerekli mRNA transfeksiyon tamponunun hacmi kuyu boyutuna bağlıdır: 6 oyuklu bir plakada transfeksiyon için 200 μL, 12 oyuklu bir plakada 100 μL vb. kullanın. Pipetleme kaybı nedeniyle her zaman biraz yedek hacim ekleyin (ancak mRNA'nın aşırı seyreltilmesini önlemek için çok fazla değil). Örneğin, 12 oyuklu bir plakanın 4 oyuğunda transfekte etmek için 4 x 100 μL = 400 μL yerine 450 μL kullanın.
2. Gerekli mRNA transfeksiyon reaktifi hacmini hesaplayın. mRNA transfeksiyon reaktifi 1:50 oranında eklenir. Örneğin, 450 μL'lik bir nihai hacim için 9 μL mRNA transfeksiyon reaktifi gereklidir.
3. Gereken toplam mRNA miktarını hesaplayın. Verimli transfeksiyon için 100.000 makrofaj başına en az 100 ng gereklidir, 200 ng daha da iyi çalışır (örneğin, 400.000 makrofajı transfekte etmek için 800 ng mRNA).
   1. Gerekli olan hesaplanan mRNA miktarını, transfekte edilmesi gereken toplam kuyu sayısı ile çarpın (örneğin, her biri 400.000 makrofaj içeren 4 kuyucuk: 4 x 800 ng = tüm kuyucuklar için toplam 3.200 ng mRNA gereklidir). Örneğin, mRNA stoğunuz 426.8 ng/μL ise, her biri 400.000 makrofaj içeren 4 kuyucuğun optimal transfeksiyonu için 7.49 μL gereklidir.
4. Hesaplanan mRNA transfeksiyon tamponu hacmini (adım 5.1.) eksi mRNA transfeksiyon reaktifi (adım 5.2) ve mRNA (adım 5.3) hacimlerini bir reaksiyon tüpüne ekleyin. Örneğin, 450 μL - 9 μL - 7.49 μL = 433.51 μL.
5. mRNA stoğunu çözün ve elüsyon tüpünü nazikçe çevirerek karıştırın. Hesaplanan mRNA hacmini (adım 5.3) mRNA reaksiyon tamponu ile reaksiyon tüpüne ekleyin (yukarıda sunulan örnekte: 433.51 μL'de 7.49 μL).
6. 5 saniye girdap yapın ve 2.000 x g'da 2 saniye aşağı döndürün.
7. mRNA transfeksiyon reaktifini 5 saniye vorteksleyin ve 2.000 x g'da 2 saniye aşağı döndürün.
8. Hesaplanan mRNA transfeksiyon reaktif hacmini (adım 5.2), mRNA transfeksiyon tamponunu ve mRNA'yı (yukarıda sunulan örnekte: 9 μL mRNA transfeksiyon reaktifi) içeren reaksiyon tüpüne ekleyin.
9. Transfeksiyon karışımını 5 saniye vorteksleyin ve 2.000 x g'da 2 saniye aşağı döndürün.
10. RT'de 15 dakika inkübe edin.
11. Bu arada, makrofajların kültür ortamını taze, ılık bir kültür ortamı ile değiştirin (bkz. adım 4.2.18. ve 4.4.5).
12. İnkübasyon adımı 5.10'dan sonra, transfeksiyon karışımını, kuyu boyutuna uygun bir hacimde makrofajları içeren kuyucuklara ekleyin (bkz. adım 5.1). Transfeksiyon karışımını dıştan kuyunun ortasına doğru bir daire şeklinde damla damla ekleyin.
13. Transfeksiyon karışımının kuyu içinde eşit dağılımını sağlamak için plakayı önce dikey ve sonra yatay yönde hafifçe sallayın. Daha sonra 37 °C ve %5 CO_2'de inkübe edin. Transfekte edilmiş mRNA tarafından kodlanan proteinin sentezi, transfeksiyondan kısa bir süre sonra başlayacaktır. En iyi sonuç için en az 6 saat inkübe edin.
14. İnkübasyondan sonra, (immüno) floresan mikroskobu, akış sitometrisi veya immünoblot ile transfeksiyon verimliliğini analiz edin veya tercih edilen deney için transfekte edilmiş makrofajları kullanın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
5-metil-CTP (100 mM)	Jena Biyosience	NU-1138S	-20 °C'de saklanır
Antarktika fosfataz	New England Biyo Laboratuvarları	M0289	-20 °C'de saklanır
Antarktika fosfataz reaksiyon tamponu (10X)	New England Biyo Laboratuvarları	B0289	-20 °C'de saklanır
anti-NEMO/IKKγ antikoru	Canlandırıcı	MA1-41046	-20 °C'de saklanır
anti-β-aktin antikoru	Sigma-Aldrich	A2228	-20 °C'de saklanır
Petri kapları 92,16 mm kamlı	Sarstedt	8,21,473	RT'de saklanır
CD11b Mikro boncuklar fare ve insan	Miltenyi Biyotec	130-049-601	4 °C'de saklanır
Cre rekombinaz + T7-Promotor ileri astar	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3', -20 °C'de saklanır
Cre rekombinaz + T7-Promotor ters astar	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3", -20 °C'de saklanır
DNA saflaştırma kiti: QIAquick PCR saflaştırma Kiti	Keçi	28104	RT'de saklanır
eGFP + T7-Promotor ileri astar	Sigma-Aldrich		5'-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3', -20 °C'de saklanır
eGFP + T7-Promotor ters astar	Sigma-Aldrich		5'-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3', -20 °C'de saklanır
Hızlı Özet arabelleği (10X)	Termo Bilimsel	B64	-20 °C'de saklanır
Hızlı Özet XbaI	Termo Bilimsel	FD0684	-20 °C'de saklanır
Düzeltme okumalı yüksek kaliteli polimeraz: Q5 Yüksek Kaliteli DNA-Polimeraz	New England Biolabs Inc	M0491S Serisi	-20 °C'de saklanır
IKKβ + T7-Promotor ileri astar	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3", -20 °C'de saklanır
IKKβ + T7-Promotor ters astar	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3", -20 °C'de saklanır
in vitro mRNA transkripsiyon kiti: HiScribe T7 ARCA mRNA kiti (polyA kuyruklu)	New England Biyo Laboratuvarları	E2060	-20 °C'de saklanır
LS Sütunları	Miltenyi Biyotec	130-042-401	RT'de saklanır
MACS Çoklu Stand	Miltenyi Biyotec	130-042-303	RT'de saklanır
mRNA transfeksiyon tamponu ve reaktifi: jetMESSENGER	Polyplus transfeksiyon	409-0001DE	4 °C'de saklanır
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plazmid	Ekle	11105	-20 °C'de saklanır
Mutant NEMOC54/347A plazmid	Ekle	27268	-20 °C'de saklanır
pEGFP-N3 plazmidi	Ekle	62043	-20 °C'de saklanır
Poli(I:C)	Calbiochem (Kireç Biyokimyası	528906	-20 °C'de saklanır
pPGK-Cre plazmidi			F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, İndüklenebilir Cre rekombinazın yeni varyantları: Cre-PR füzyon proteininin yeni bir mutantı, gelişmiş duyarlılık ve genişletilmiş bir indüklenebilirlik aralığı sergiler. Nükleik Asitler Res. 29, 47e (2001). -20 °C'de saklanır
Yalancı UTP (100 mM)	Jena Biyosience	NU-1139S	-20 °C'de saklanır
QuadroMACS Ayırıcı	Miltenyi Biyotec	130-090-976	RT'de saklanır
Sıçan-anti-fare CD11b antikoru, APC-konjuge	Biyo Efsane	101212	4 °C'de saklanır
Sıçan-anti-fare F4/80 antikoru, PE konjuge	eBiyobilim	12-4801-82	4 °C'de saklanır
rekombinant M-CSF	Peprotech teknolojisi	315-02	-20 °C'de saklanır
RNA saflaştırma kiti: MEGAclear transkripsiyon temizleme kiti	ThermoFisher Bilimsel	AM1908	4 °C'de saklanır
RNAse parçalayıcı yüzey aktif madde: RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	RT'de saklanır
E.coli O111: B4'ten ultra saf LPS	Canlılık		-20 °C'de saklanır
Yabani tip IKKβ plazmid	Ekle	11103	-20 °C'de saklanır
Yabani tip NEMO plazmid	Ekle	27268	-20 °C'de saklanır