NOT: Aşağıdaki protokol, Yakın kızılötesi fotoimmünoterapi (NIR-PIT) kullanarak belirli hücreleri ortadan kaldırmak için gerekli adımları açıklamaktadır. NIR-PIT ve hücre canlılığı ile ilgili kontroller ve diğer ayrıntılar başka bir yerde bulunabilir.
>1. Kızılötesi 700'ün (IR700) Monoklonal Antikorlara (mAb) Konjugasyonu
- 0.1 M disodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) (pH8.6) çözeltisinde 2-5 mg / ml'de ilgilenilen mAb'yi hazırlayın.
- 6.8 nmol mAb ile 30.8 nmol 10 mM IR700'ü 0.1 MNa2HPO4çözeltisinde (pH 8.6) bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırın ve alüminyum folyo ile kaplanmış RT'de 1 saat inkübe edin.
- PD-10 kolonunu (Malzeme/Ekipman Tablosuna bakın) 15 ml PBS ile iki kez yıkayın. Örneği adım 1.2'den yükleyin.
- Karışımı, üreticinin talimatlarına göre PBS elüsyonu ile PD-10 sütunu aracılığıyla saflaştırın.
NOT: Burada, elüsyon IR700'ün bant rengi boyuncaydı. 300 μl'lik bir numune için, PBS elüsyon fraksiyonu tipik olarak 2,5 ml ila 4,4 ml arasındadır.
- Bir spektrofotometre ile 595 nm'de emilimi ölçerek Coomassie boyama ile protein konsantrasyonunu belirleyin. Her bir mAb molekülüne konjuge edilen florofor moleküllerinin sayısını doğrulamak için 689 nm'de absorpsiyon ile IR700 konsantrasyonunu belirleyin.
NOT: Bir spektrofotometre ile 1 mAb'de IR700 moleküllerinin optimal konjugasyon sayısının belirlenmesi önemlidir. Genel olarak, 1 mAb molekülünde yaklaşık 3 IR700 molekülü hem in vitro hem de in vivo çalışma için idealdir. mAb ve IR700'ün bağlı olup olmadığını doğrulamak için yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve sodyum dodesil-sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemleri kullanılabilir.
- Protein konsantrasyonu belirlendikten sonra 4 °C'de saklayınız.
2. Karışık 3D Hücre Kültürünün Hazırlanması (Karışık Sferoid)
- Asılı damla plakaların plaka rezervuar bölümüne steril su (yaklaşık 1 ml) uygulayın.
- İlgilenilen hücre tiplerinin çeşitli oranlarını hazırlayın - A431-lusiferaz-yeşil floresan protein (A431-luc-GFP) hücreleri ve 3T3-kırmızı floresan protein (3T3-RFP) hücreleri - her numune toplam 5.000 hücre içeren, 50 μl kültür ortamında süspanse edilmiştir.
NOT: Hücre tipine bağlı olarak 1:100, 10:100, 25:100, 50:100 vb. kültür ortamındaki ilgili hücre türlerinin oranlarını hazırlayın.
- Karışımı, 37 ° C ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir inkübatörde 96 kuyulu damla plakasında 5-7 gün inkübe edin. Kültür ortamını 2 günde bir değiştirin. NOT: 3B sferoidi tam olarak yapmak için, 3B şekiller oluşturmadan önce hücre içeren damlalar kolayca düştüğü için plakayı nazikçe tutun.
- 10X - 40X büyütmede ters çevrilmiş bir parlak alan mikroskobu kullanarak sferoidlerin morfolojisini ve boyutunu gözlemleyin. NOT: Hücre tiplerine ve asılı damla boyutuna bağlı olmasına rağmen, 96 kuyulu asılı damla plakasında 7 günlük inkübasyondan sonra sferoidin çapının 400-600 μm civarında olduğundan emin olun.
>3. Karışık 3D Hücre Kültürü için In Vitro NIR-PIT
- Asılı damla plakalarının ortamını 10 μg / ml antikor-fotoemici konjugat (APC) içeren ortama değiştirin ve 37 ° C ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir inkübatörde 6 saat inkübe edin.
- 6 saatlik inkübasyondan sonra, sferoidi iki kez taze kültür ortamıyla (fenol kırmızısı içermez) yıkayın. Sferoidi, ucu kesilmiş 200 μl'lik steril bir pipet ucu kullanarak 100 μl taze fenol kırmızısı içermeyen kültür ortamı içeren cam tabanlı 50 mm'lik bir tabağa nazikçe aktarın. Her tabağa bir sferoid yerleştirin.
- Morfoloji değişimini tespit etmek için sferoidi ters çevrilmiş bir parlak alan mikroskobu ile gözlemleyin. Optik raportörleri (örneğin, GFP ve RFP) gözlemlemek için aşağıdaki filtre ayarlarıyla floresan mikroskobu kullanın: GFP — 469 nm uyarma filtresi ve 525 nm emisyon filtresi; RFP — 559 nm uyarma filtresi ve 630 nm emisyon filtresi.
- Işınlama için ışık yayan diyotu (LED) cam tabanlı çanağın üzerine yerleştirin.
NOT: Sferoidler, mikroskopta veya laminer başlıkta NIR ışığına maruz bırakılabilir.
- NIR ışığının güç yoğunluğunu bir optik güç ölçer ile ölçün. Bu ölçüme göre, NIR ışığını 670 J/cm710 J/cm 2.
'de 2 ila 2 nm dalga boylarında ışık yayan ışık yayan diyotlar (LED'ler) aracılığıyla ışınlayın
NOT: LED ışık, yaklaşık 5 inçlik maksimum derinliğe nüfuz edebilir. NIR-PIT'in sitotoksik etkileri, güç, yoğunluk ve maruz kalma süresinden bağımsız olarak yalnızca verilen enerjiye bağlıdır.
- Işınlamadan sonra, sferoidi 50 μl taze kültür ortamı içeren yeni bir asma damla plakasına aktarın ve 37 ° C ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir inkübatörde 1 gün inkübe edin.
- Sferoidi, ucu kesilmiş olarak steril 200 μl'lik bir pipet ucu kullanarak 100 μl taze kültür ortamı (fenol kırmızısı içermez) içeren cam tabanlı bir tabağa nazikçe aktarın. Adım 3.3'te açıklanan filtre ayarlarını kullanarak NIR-PIT'ten 1 gün sonra sferoidi bir floresan mikroskobu ile gözlemleyin.
- Ortama 2 μg/ml'lik bir nihai konsantrasyonda propidyum iyodür ekleyerek veya bir floresan mikroskobu kullanarak sitoplazmik GFP-floresan kaybıyla ölü hücreleri tespit edin (Şekil 1B).
- Hedef hücreler tamamen elimine edilmediyse 3.1-3.6 adımlarını tekrarlayın.
