İnsan Bağışıklık Sistemi Fareleri Oluşturmak için Kordon Kanı Hematopoetik Kök Hücrelerinin İzole Edilmesi

Özet

Kaynak: Lanis, J. M., et al. İnsan Tümörleri Taşıyan İnsanlaştırılmış Bir Fare Modelinde Kanser İmmünoterapötiklerinin Test Edilmesi. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu videoda, insan bağışıklık sistemi (HIS) fareleri oluşturmak için bir teknik gösterilmektedir. CD34⁺ hematopoetik kök hücreler (HSC'ler), antikor kaplı manyetik boncuklar kullanılarak insan kordon kanı buffy coat hücrelerinden izole edilir. CD34⁺ HSC'ler, sitokinlerle zenginleştirilmiş ve kriyoprezervasyonlu bir büyüme ortamında genişletilir. Son olarak, çözülmüş HSC'ler, HIS fare modelini oluşturmak için immün yetmezliği olan bir fare yavrusuna enjekte edilir.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. HIS farelerinin nesli

1. BALB/c -Rag2^null Il2RγC^null Sirpα^NOD (BRGS) farelerinin fare yetiştiriciliği
   not: Bu suş, T, B veya doğal öldürücü (NK) hücreleri olmadan son derece immün yetmezliklidir. Bu nedenle, fırsatçı enfeksiyonları önlemek için sıkı önlemler alınmalıdır. Koloniyi normal bir diyetle alternatif 2 haftalık bir programda trimetoprim ve sülfadiazin içeren bir diyette tutun. Mümkün olan en yüksek önlem alma muhafaza odasında bulundurun (örneğin, sınırlı erişime sahip bir bariyerli duş tesisi).
   1. Damızlık olarak BALB/c -Rag2^null Il2RγC^null Sirpα^NOD (BRGS) ve BALB/c Rag2^null Il2RγC^null Sirpa^Balb/c (BRG) homozigot farelerin kolonilerini koruyun.
   2. İnsan kök hücrelerinin alıcısı olarak kullanılmak üzere BRGS^B/N yavruları oluşturmak için BRGS^N/N×BRG^B/B'yi üretin. Bu kolonide^{BGS B/N,} BRGS^N/N'den daha sağlıklıdır ve eşdeğer seviyelerde (BRG'den daha fazla) aşılanır.
2. Göbek kordonu kanından (CB) CD34+ insan kök hücre izolasyonu
   not: Bu işlem için herhangi bir antibiyotik kullanılmaz. Bu nedenle, iyi bir steril teknik şarttır.
   1. Sterilize edilmiş bir biyogüvenlik kabinine (BSC) 50 mL'lik bir konik tüp rafının yanı sıra 3x 15 mL ve ~10x 50 mL'lik konik tüpler yerleştirin. Bir kan alma torbasına% 70 etanol püskürtün ve BSC'de kurumaya bırakın.
   2. CB yoğunluk gradyan izolasyonu için gereken 50 mL konik tüp sayısını hesaplayın = CB hacmi/15, yukarı yuvarlanmış ve eşit bir tüp numarasına ulaşmıştır. Tüp başına kan hacmini hesaplayın = CB hacmi/tüp sayısı. CB torbasından her bir konik tüpe dikkatlice kan dökün; bu, tüp başına maksimum 15 mL'dir. Otomatik pipetleyici ve 25 mL serolojik pipet kullanarak kanı 1:1 oranında steril PBS ile yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
   3. Düşük hızda otomatik bir pipetleyici ve 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, arayüzü bozmadan oda sıcaklığında (RT) 1.077 g/mL yoğunluk gradyan çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ile kanı yavaşça yerleştirin. Pipet ucunun tüpün tabanına temas etmemesini sağlayın. Tüm tüpler için tekrarlayın. Ardından, yoğunluk gradyanının korunmasını sağlamak için RT'de frenleme olmadan 850 x g'da 30 dakika santrifüjleyin.
   4. 1.077 g/mL yoğunluk gradyanının üzerindeki hücresel buffy kaplamayı bulutlu beyaz bir tabaka olarak hayal edin. 25 mL'lik bir serolojik pipet ve otomatik pipetleyici kullanarak plazma katmanını buffy kaplamanın yaklaşık 10 mL üzerine kadar çıkarın ve atın.
   5. Buffy ceketi steril bir transfer veya serolojik pipet ile toplayın. Hücreleri yukarı çekmek için ampulü serbest bırakırken (veya yavaşça pipetlerken) hücreleri konik borunun yanından kazımak için pipeti bir spatula gibi kullanın. İki adet 50 mL'lik konik tüpten gelen buffy kaplamaları tek bir yeni 50 mL'lik konik tüpte birleştirin.
   6. Her bir konik tüpe% 2 fetal sığır serumu (FBS) içeren 45 mL steril Hanks'in dengeli tuz solüsyonunu (HBSS) dökerek hücreleri yıkayın. RT'de 360 x g'de 11 dakika santrifüjleyin.
   7. Yıkama ortamını tüm tüplerdeki peletlere kadar aspire edin. %2 FBS içeren 10 mL HBSS'deki ilk peleti yeniden süspanse etmek için 10 mL'lik bir serolojik pipet ve otomatik pipetleyici kullanın. Her peleti aynı 10 mL HBSS'de yeniden süspanse edin ve tüm hücreleri tek bir tüpte toplamak için her tüpü ek 10 mL HBSS ile durulayın.
   8. Konik tüpe% 2 FBS içeren 45 mL steril HBSS dökün. 360 x g'da, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
   9. Yıkama tamponunu hücre peletine kadar aspire edin ve peleti 20 mL manyetik hücre ayırıcı tamponunda yeniden süspanse edin (Malzeme Tablosuna bakınız). Metilen mavisi renginde 1:20 seyreltmede hücreleri bir hematitometre ile saymak için küçük bir alikotu çıkarın. Mavi ve beyaz hücrelerin sayısını ekleyin. 360 x g'da, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin
      not: Bu protokol manyetik boncuk teknolojisini kullanır (bkz. Malzeme Tablosu). Protokol, CD34 + kök hücrelerinin yeterli saflığı ve verimi ile herhangi bir hücre ayırma teknolojisi ile kullanım için değiştirilebilir.
   10. Süpernatanı aspire edin ve kordon kanından izole edilen CD34+ hücre peletini 1 x 10⁸ hücre başına 300 μL manyetik hücre ayırıcı tamponunda yeniden süspanse edin. Önce 100 μL Fc reseptörü (FcR) bloke edici reaktif ve ardından 1 x 10⁸ hücre başına 100 μL CD34+ manyetik boncuk ekleyin. 4 °C'de 30 dakika inkübe edin (buz yok).
   11. 1 x 10⁸ hücre başına 5 mL manyetik hücre ayırıcı tamponu ekleyin ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 360 x g'da döndürün. Yıkama adımını tekrarlayın ve peleti "fraksiyonsuz" etiketli 15 mL konik bir tüpte 1 x 10⁸ hücre başına 500 μL manyetik hücre ayırıcı tamponunda yeniden süspanse edin.
   12. İki adet 15 mL'lik konik tüpü "CD34-" ve "CD34+" olarak etiketleyin. Üç adet 15 mL'lik konik tüpü (fraksiyonsuz, CD34- ve CD34+) sırasıyla A1, B1 ve C1 yuvalarına bir soğutma rafına yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın). Üreticinin cihaz talimatlarına göre, bir BSC'deki otomatik manyetik hücre ayırıcı (Malzeme Tablosuna bakın) üzerindeki iki sütunlu pozitif seçim programını kullanarak hücreleri ayırın.
3. CD34+ insan kök hücrelerinin genişletilmesi ve dondurulması
   1. Geri kazanılan CD34+ hücre süspansiyonunun (2 mL) 10 μL'sini bir hemositometre slaytında çıkarın ve hücreleri 10x büyütme altında sayın. Hücre sayısını 34 x 2 ile çarparak toplam CD10+ hücre sayısını hesaplayın⁴. Dondurulacak flakon sayısını hesaplamak için toplam CD34 + hücre sayısını 250.000'e bölün (in vitro genişlemeden önce fare yavrusu başına 50.000 hücre).
   2. 40 ng/mL kök hücre faktörü, 20 ng/mL FMS benzeri tirozin kinaz 3 ligand (Flt3L) ve 10 ng/mL interlökin-6 (IL-6) ile desteklenmiş CB ortamı Iscove'un %10 fetal buzağı serumunu (FCS) (artı filtreleme kaybı için ekstra 1 mL) hazırlayın ve 0.22 μm'lik bir filtreden geçirin. CD34 + hücrelerini mL CB ortamı başına 100.000'de yeniden süspanse edin ve 37 ° C'de inkübe edin. 3. günde, hücreleri içeren şişeye ve sitokinli CB ortamına sitokin içermeyen eşdeğer hacimde CB ortamı ekleyin.
      not: Bu sitokinlerin CB ortamına eklenmesi, farklılaşmayı önlerken CD34 + hücrelerinin hayatta kalmasını ve genişlemesini destekler.
   3. Genişletilmiş CD34 + hücrelerini 5. günde hasat edin. Hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyin ve 50 mL'lik konik bir tüpte toplayın. Şişenin altını kaplayacak kadar CB ortamı ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, şişenin tüm tabanını kazıyın. Tüm ortamı aynı 50 mL'lik tüpte toplayın ve 11 dakika boyunca 360 x g'da santrifüjleyin.
   4. Hücreleri 2 mL CB ortamında yeniden süspanse edin. Pipetteki son damlayı saymak için 96 oyuklu bir plakaya saklayın. Hücreleri tripan mavisi içinde 1: 1 oranında seyreltin ve hemasitometreye 10 μL ekleyin, ardından dört kadrandan hücreleri sayın ve ortalamasını alın. Hücre sayısını 4 x 10⁴ ile çarparak toplam CD34+ hücre sayısını hesaplayın ve canlılığı kaydedin.
   5. n+1 mL dondurma ortamı yapın, burada n, adım 1.3.1'de hesaplanan dondurma şişelerinin sayısıdır. FBS'ye %10 (h/h) dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyerek dondurma ortamını hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Kriyovialleri CB #, CD34 + d5 ve tarih ile etiketleyin.
   6. CD34+ hücrelerini 360 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca döndürün. Ortamı pelete edin ve hücre peletini dondurma ortamında yeniden süspanse edin. Her şişeye 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve kalanları şişeler arasında eşit olarak bölün. Şişeleri 4 °C'ye soğutulmuş bir izopropanol hücre dondurucusuna ekleyin, -80 °C'ye yerleştirin ve >90 gün saklamak için sıvı nitrojene aktarın.
4. Fare yavrularının ışınlanması
   1. BRGS^B/N yavrularını doğumdan 1-3 gün sonra dolgulu otoklavlanmış plastik bir kutuya koyun. Yavrularla birlikte az miktarda yatak takımı ekleyin. Kutuyu kafes numarası ve yavru sayısı ile etiketleyin.
   2. Işınlayıcıyı (Malzeme Tablosuna bakınız) 300 rad'lık bir doz için ayarlayın. Yavru kutusunu ışınlayıcıya yerleştirin ve 300 rad'a maruz bırakın. Yavruları kafeslerine geri götürün, bir yığına koyun ve üzerlerini yatak takımlarıyla örtün.
5. Yavru enjeksiyonları ve CD34+ hücre hazırlığı
   1. Işınlamadan ~ 3 saat sonra CD34 + hücre hazırlığına başlayın. 10 mL CB ortamını 50 mL konik bir tüpte ısıtın. Tüm adımları steril bir BSC'de gerçekleştirin.
   2. Enjekte edilecek her dört ila altı yavru için in vitro genişletilmiş ve donmuş CD34 + hücrelerinden oluşan bir şişe alın. 55 ° C'de, sadece az miktarda buz görünene kadar hızla çözdürün ve hücreleri ısıtılmış CB ortamına ekleyin (flakon hala dokunulamayacak kadar soğuk olmalıdır.) Her şişeyi durulamak için 1 mL ortam kullanın ve hücreleri 4 ° C'de 12 dakika boyunca 360 x g'da döndürün.
      NOT: 55 ° C'de hızlı çözülmenin, 37 ° C'de çözülmeye göre daha iyi hücre canlılığı (% 90 -% 95) sağladığı bulunmuştur.
   3. Ortamı dikkatlice aspire edin. (Küçük) peleti 2 mL CB ortamında yeniden süspanse edin, hafifçe karıştırın ve bir sayma plakasındaki tek bir oyuğa ~ 30 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Tripan mavisi ile 1: 1 oranında seyreltin, ardından bir hemositometreye 10 μL ekleyin ve hücreleri dört kadrandan sayın ve ortalamasını alın.
   4. Hücre sayısını 34 x 4 ile çarparak toplam CD10⁺ hücre sayısını hesaplayın ve ardından canlılığı kaydedin. 360 x g'da 4 °C'de 12 dakika döndürün.
   5. Ortamı dikkatli bir şekilde aspire edin ve hücre peletini enjekte etmek için n + 1 yavru başına 100 μL steril PBS içinde yeniden süspanse edin, bu da fare başına 250.000-450.000 CD34 + hücresi ile sonuçlanır. Konik tüpü bir taşıma kabına buzun üzerine yerleştirin ve yavru enjeksiyonu için vivaryuma gidin.
   6. Bir ısı lambası, çocuk bezi, 1 mL şırınga, 18 G iğne, 30 G iğne ve CD34 + hücre preparatını steril kaplarda vivaryum BSC'ye getirin. Isı lambasının altına ~ 2 ft steril bir bebek bezi yerleştirin. Enjekte edilecek çöpün bulunduğu kafesi alın ve BSC'ye yerleştirin.
   7. Şırıngayı 18 G eğimli bir iğne ile monte edin. Konik borunun açısını iğnenin eğimi ile eşleştirerek, hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın ve çekin. Yavruları ısıtmak için bebek bezinin üzerine yerleştirin (aşırı ısınmaya dikkat edin). Şırıngadaki havayı çıkarın ve 18 G'lik iğneyi 30 G'lik iğneyle değiştirin ve ardından hücre süspansiyonu iğne ucuna gelene kadar şırıngayı dikkatlice itin.
      not: Alternatif olarak, bir insülin şırıngası kullanılabilir.
   8. Her seferinde bir yavruyu bebek bezinin kenarına, ısı lambasından uzağa götürün. Yavruyu başparmak ve işaret parmağının altında yan yatırarak yüzün net bir şekilde görülmesini sağlayın. Kulağın olacağı yerin altındaki yanak boyunca oluşan damara dikkat edin. İğneyi göze en yakın damara (IV) sığ bir şekilde yerleştirin ve yavaşça 50 μL hücre enjekte edin.
   9. Deri altı enjeksiyonundan bir kabarcık oluşup oluşmadığını kontrol edin. Eğer öyleyse, iğneyi daha derine sokun ve hücreleri enjekte etmeye devam edin. Başarılı olduğunda küçük bir damla kan / hematom görünecektir.
   10. Yavru hala hareketsiz durumdayken, 50 μL hücre daha (IV + IH yavrusu başına toplam 100 μL) ile intrahepatik enjeksiyon (IH) gerçekleştirin. Karaciğer, beyaz süt bandı ile göğüs kafesi arasında karanlık bir nokta olarak görselleştirilebilir. Enjekte edilen yavruyu, enjekte edilmemiş yavrulardan daha uzakta bir bebek bezine yerleştirin ve ısıtın.
       not: IV enjeksiyonu, tek başına IH enjeksiyonundan daha iyi uzun süreli kimerizm ile sonuçlanır, ancak IV enjeksiyonları her zaman başarılı değildir. Bu nedenle, enjeksiyonun IV ve IH arasında bölünmesi, farelerin daha büyük bir yüzdesine aşılanmayı sağlar.
   11. Tüm yavrular için hem yüz damarı hem de IH enjeksiyonlarını tekrarlayın. Kanı temizleyin, yavruları kafeslerindeki yuvaya geri koyun ve yatak takımlarıyla örtün.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 mL şırınga, iğneli	McKesson	1031815
15 mL tüpler	Grenier Biyo-Bir	188271
2-merkaptoetanol	Sigma	M6250
50 mL tüpler	Grenier Biyo-Bir	227261
AutoMACS Pro Ayırıcı	Miltenyi	130-092-545
Bsa	Balıkçı Bilimsel	BP1600100
Chill 15 Raf	Miltenyi	130-092-952
Embriyonik Kök Hücre FCS	Gibco (Gibco)	10439001
Eppendorf Tüpleri; 1.5 mL hacim	Grenier Biyo-Bir	616201
Excel	Microsoft Bilişim Sistemleri
FBS (FBS)	Kriter	100-106 500 mL
Ficoll Hypaque	GE Sağlık	45001752
cam pipetler	DWK Yaşam Bilimleri	63A53
Ca ve Mg ile HBSS	Sigma	55037C
Çoklu Rad 350	Hassas Röntgen
Pbs	Corning	45000-446
prizma	Grafik Defteri
Kayıt Hu FLT3L	Ar-Ge sistemleri	308-FK-005/CF
Kayıt Hu IL6	Ar-Ge sistemleri	206-IL-010/CF
Rec Hu SCF	Ar-Ge sistemleri	255SC010
Serolojik pipetler 25 mL	Balıkçı Bilimsel	1367811
Steril filtre	Nalgene Belediyesi	567-0020
Steril moleküler su	Sigma	7732-18-5
Yeti Hücre Analiz Cihazı	Biyo-Rad	12004279

Belediyesi Serisi · Serisi arası Serisi