Tam Rezeke Edilmemiş Subkutan Tümörü Olan Bir Fare Modelinde Adjuvan Tedavi

Özet

Kaynak: Rwandamuriye, F. X. et al., Neo) Adjuvan Tedavileri Test Etmek İçin Tam Olarak Rezeke Edilmemiş Yumuşak Doku Sarkomunun Bir Fare Modeli.J. Vis. Uzm.(2020)

Bu video, tam olarak rezeke edilmemiş deri altı tümörleri olan bir fare modelinde adjuvan veya ek tedavinin test edilmesini göstermektedir. Kısmen tümör rezeke edilen fare, T düzenleyici hücrelerin anti-sitotoksik proteinini hedef alan, potansiyel olarak tümör büyümesini azaltan ve etkili adjuvan tedavi öneren bir antikor ile tedavi edilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hücrelerin aşılanması

1. Hücrelerin ve hayvanların hazırlanması
   1. Hücre hattının önerilen ortamda tutulduğundan emin olun. Örneğin, 2 mM L-glutamin,% 10 fetal sığır serumu, 20 mM 4- (2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), 0.05 mM 2-merkaptoetanol, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamında WEHI 164 hücre hattını koruyun.
      not: Kriyojenik depodan çıkarıldıktan sonra hücreleri en az 3 ve en fazla 5 kez pasajlayın. Optimum hücre canlılığını sağlamak için, hücreler %70-80 arasında birleştiğinde bölünmelidir. Tümör hücre hatları mikoplazma için test edilmelidir, çünkü enfeksiyon hücre büyümesini değiştirebilir ve in vivo olarak bağışıklık tepkisini etkileyebilir.
   2. Aşılamadan bir gün önce, fareleri clippers.
      kullanarak sağ alt kanattan tıraş edin not: Bu deneyde 8-12 haftalık normal kilolu (16-22 gram) dişi BALB/c fareleri kullanıldı.
   3. Aşılama gününde, tripsinizasyon ile% 70-80 birleştiğinde WEHI 164 hücrelerini hasat edin.
      1. Kültür ortamını doku kültürü şişelerinden aspire edin ve ardından fetal sığır serumunun (FBS) kalan izlerini gidermek için steril fosfat tamponlu çözelti (1x PBS) ekleyin.
      2. PBS'yi doku kültürü şişelerinden aspire edin. 3 mL% 0.05 tripsin ekleyin (bir T75 şişesi için) ve ardından şişeyi, hücrelerle şişenin tüm yüzeyi tripsin ile kaplanacak şekilde döndürün.
      3. Şişeyi 37 °C'de,% 5 CO₂ inkübatörde 3 dakika inkübe edin. Hücrelerin yerinden çıkıp çıkmadığını görmek için şişenin kenarlarına dokunarak hücreleri periyodik olarak kontrol edin.
      4. Şişeleri hücre kültürü inkübatöründen çıkarın ve tripsini nötralize etmek için FBS ile takviye edilmiş 5 mL ortam ekleyin.
         not: Hücreleri tripsin içinde gerekenden daha uzun süre bırakmayın, çünkü bu hücrelere zarar verebilir ve düşük hücre canlılığına yol açabilir.
      5. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için pipet süspansiyonunu birden çok kez yapın. Hücre süspansiyonunu konik bir santrifüj tüpüne aktarın.
      6. 3 dakika boyunca 350 x g'da döndürerek pelet hücreleri.
   4. Hücreleri 1x PBS'de üç kez yıkayın.
      1. Hücreleri 50 mL steril 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri yıkayın. 3 dakika boyunca 350 x g'da döndürerek pelet hücreleri.
      2. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 15 mL steril 1x PBS'de yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri yıkayın. 3 dakika boyunca 350 x g'da döndürerek pelet hücreleri.
      3. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri tam olarak 10 mL steril 1x PBS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri adım 1.1.4.2'deki gibi yıkayın ve sayım için az miktarda (yaklaşık 100 μL) hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın. 3 dakika boyunca 350 x g'da döndürerek pelet hücreleri.
   5. Bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak hücre numarasını belirleyin. Hücreleri steril 1x PBS'de 5 x 10⁶ hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun.
      not: Tekrarlanabilir tümör büyümesini sağlamak için tümör hücrelerinin canlılığı %80'e eşit veya %80'in üzerinde olmalıdır.
2. Deri altı aşılama
   1. Hücre süspansiyonunu iyice karıştırın ve bir şırıngayı steril 1x PBS'de 100 μL hücre süspansiyonu (5 x 10⁵ hücreli) ile 26 G iğne ile doldurun. Bir sonraki şırıngayı yüklemeden önce hücreleri karıştırmayı tekrarlayın.
      not: Canlılığı korumak için hücreleri prosedür boyunca buz üzerinde tutun.
   2. Fareyi uygun şekilde kısıtlayın ve sağ alt kanada erişim sağlayın. Fareyi traşlı sağ alt kanatta deri altından aşılayın.
      not: Deri altında görünmesi gereken iğneyi hafifçe kaldırarak aşılamanın zar zarında olmadığından emin olun. Aşılamayı takiben cilt altında kabarcık benzeri bir yumru oluşmalıdır.
   3. Fareleri geçerli etik onayın gerektirdiği şekilde izleyin ve tümörler yaklaşık 50 mm'lik bir boyuta ulaştığında cerrahi rezeksiyon yapın².

2. Tümörün kısmi cerrahi rezeksiyonu

NOT: Bu protokol İKİ araştırmacı gerektirir; biri cerrahi prosedürler için (CERRAH) ve diğeri fare izleme (ASSISTANT) için.

1. Ameliyat kurulumu
   1. Aşılamadan sonraki 12. günde, tümörler yaklaşık 50^mm2'lik bir boyuta ulaştığında, ameliyattan 30 dakika önce farelere 100 μL (0.1 mg / kg) buprenorfin sc ile boynun ensesine doz verin.
   2. Cerrahi alanı bir tezgah kaplaması ile kaplı bir ısı yastığı ile ayarlayın ve anestezi için bir burun konisi ayarlayın. Kullanmadan önce cerrahi aletleri ve her hayvan arasında bir ısı boncuğu sterilizatörü kullanarak sterilize edin, kullanmadan önce aletlerin soğumasını bekleyin. Aşağıdaki cerrahi ekipmanı temiz ve kolay erişilebilir bir yerde bulundurun: klorheksidin, çubuk, gazlı bez, göz jeli, iki kavisli forseps, makas, klips aplikatör, klips çıkarıcı ve klips yedekleri (Şekil 1A, 1B).
   3. Isıtma odasını 37 °C'ye ısıtın ve geri kazanım için başka bir ısı yastığı kurun (Şekil 1C). Sterilize edilmiş aletleri otoklavlanmış pedler gibi steril bir yüzeye yerleştirin.
2. Anestezi
   1. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve solunum hızı dakikada yaklaşık 60 nefese (saniyede 1) yavaşlayana kadar fareyi %4 izofluran (%100 oksijende %4) ile uyuşturun (bu genellikle <1 dakika sürer).
      not: Boğulma ve ölüme yol açabileceğinden fareyi haznede çok uzun süre bırakmayın. Bir seferde sadece bir fareyi anestezi altında bulundurun.
   2. Fareyi ameliyat masasındaki ısı yastığına aktarın, fareyi burnu burun konisine gelecek şekilde yerleştirin ve 0,5 L/dk akış hızında %100 oksijende %3-4 izofluran ile anestezik durumu koruyun. Anestezi derinliğinin korunduğundan emin olmak için solunum hızını izleyin.
      not: ASİSTAN, doğru anestezi seviyesinin korunduğundan emin olmak için ameliyat boyunca farenin solunumunu izlemelidir. Solunum çok yavaşlarsa anestezik konsantrasyonu düşürün veya anestezi derinliği çok sığsa konsantrasyonu artırın. Fare nefes almaya başlarsa, fareyi burun konisinden çıkarın, anestezik konsantrasyonu azaltın ve tekrar burun konisine yerleştirmeden önce solunumun normale dönmesini bekleyin.
   3. Ameliyata başlamadan önce farenin tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için bir "tutam testi" ve "kornea refleks testi" yapın.
      not: Farenin herhangi bir parçasının hareket etmesi, farenin tam olarak uyuşturulmadığının bir göstergesidir. Anestezik konsantrasyonu artırılarak hayvana hemen ek anestezik verilmelidir.
   4. Göz kuruluğunu önlemek için farenin gözlerini az miktarda oftalmik jel ile kapatın.
3. Cerrahi prosedür
   1. Cerrahi bölgeyi 3 kez alkolik klorheksidin ile temizleyin. Forseps ve bir makas kullanarak, tümörden 3 mm uzakta, sırt tarafı boyunca 1 cm'lik düz bir kesi yapın (Şekil 2A, 2B).
      not: Her farede insizyonun 1 cm'ye standartlaştırılması (bir cetvel kullanarak), fareler arasındaki yara iyileşmesinin eşit şekilde değerlendirilmesine olanak tanır. İnsizyonun tümörden 3 mm uzağa yerleştirilmesi, yaradan sızıntı olmadan sonraki intratümöral adjuvan tedaviye izin verir.
   2. Cımbız kullanarak, tümör ve periton arasındaki fasya ve deri altı yağ dokusunu çekin. Deri altı tümör normalde cilt tarafına yapışıktır.
   3. Cımbız kullanarak tümör taşıyan taraftaki cildi nazikçe tutarak yarayı açın ve tümörü dışarıdan görülebilecek şekilde "ters çevirin" (Şekil 2C, 2D).
      not: Tümörün debulke edilecek bölümü, yarayı kapatmak için yeterli cilde sahip olmak için açıklığa en yakın olmalıdır. Tümörü çıkarırken cildi kesmemeye dikkat edin.
   4. Bir makas kullanarak, tümörün açıklığa en yakın tabanından başlayarak tümör kapsülünü çıkarmak için ikiye bölün.
   5. % 50 debulk ameliyatı için, tümörün ortasından kesin. Kavisli forseps kullanarak, tümörün çıkarılacak bölümünü kaldırın (% 50); Şişirilmiş alandan kalıntıları toplayın.
   6. %75 debulk için, yukarıdaki bölüm 2.3.5'teki gibi %50'lik bir tümör debulk gerçekleştirin. Daha sonra tümörün kalan %50'sini yarıya bölün ve yukarıda anlatıldığı gibi kavisli forseps kullanarak tümörün %25'ini alın.
4. Ameliyat bölgesinin kapatılması
   1. Kalan tümörü cildin altına geri yerleştirin ve forseps kullanarak cilt kanatlarını bir araya getirin ve cildi yara boyunca hizalayın.
   2. Cildi yaranın kenarından 5 mm uzakta bir arada tutun ve forsepslere en yakın taraftan başlayarak yarayı kapatmak için cerrahi klipsler kullanın. Altta yatan hiçbir dokunun açığa çıkmadığından emin olmak için gerektiği kadar klips uygulayın. Genellikle klipsler arasında 2 mm boşluk bırakılarak üç ila dört klips uygulanır.
      not: Herhangi bir klips iyi uygulanmamışsa, bunları bir klips çıkarıcı kullanarak çıkarın ve yeni klipslerle değiştirin.
5. Farelerin kurtarılması
   1. Fareleri ılık (37 °C) ısıtma odasına koyarak iyileşmelerine izin verin.
   2. Farenin kafesini ısı yastığının üzerine yerleştirin. Anesteziden kurtulana kadar (uyanık ve yürürken) ısıtma odasındaki fareleri izleyin ve ardından fareleri tekrar kafese koyun. Fareler daha aktif hale gelene kadar kafesi 10 dakika daha ısı yastığı üzerinde bırakın.
   3. Farelere ıslak ve yumuşak yiyecekler verin. Ameliyattan 1 saat sonra fareleri iyileşme için izleyin ve klipslerin yerinde kaldığından emin olun. Hayvanların gözetimsizken sıcaklığı kendi kendine düzenlemesine izin vermek için kafesin ısı yastığının yarısı açık/yarısı kapalı olduğundan emin olun.
   4. Ameliyattan 6-8 saat sonra (günün sonunda) farelere 0.1 mg / kg buprenorfin (boynun ensesinde deri altından 100 μL) dozlayın. Ertesi sabah erkenden fareleri izleyin ve farelere tekrar 0.1 mg / kg buprenorfin (boynun ensesinde deri altında 100 μL) dozlayın. Gerektiği kadar daha fazla ıslak mama verin.
   5. Önümüzdeki yedi gün boyunca fareleri günlük olarak izleyin. Klipsler, klips sökücü kullanılarak yedi gün sonra çıkarılabilir.
6. Adjuvan veya neoadjuvan tedavi
   1. İlgilenilen tedaviye bağlı olarak, fareleri herhangi bir zamanda (neo) adjuvan tedavi ile perioperatif olarak tedavi edin.
   2. Örneğin, fareleri aşılamadan sonraki 15. günde intraperitoneal olarak (i.p.) bir doz 100 μg anti-CTLA-4 ile veya aşılamadan sonraki 15, 17. ve 19. günlerde üç doz 200 μg anti-PD-1 ip ile tedavi edin.

Sonuçlar

Şekil 1: Ameliyat düzeneğinin temsili görüntüleri.(A) Cerrahi aletleri (adım 2.1'de listelenmiştir) ve anestezik makinesini gösteren cerrahi kurulumunun tam bir görüntüsü. (B) Ameliyat masasının tüm materyallerin kolayca ulaşılabileceğini gösteren bir anlık görüntüsü. (C) Farenin geri kazanılması için bir ısıtma odası ve bir ısıtma yastığı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
26 gauge 0.5 mL insülin şırıngası	Becton Dickinson, Avustralya	326769	hiç kimse
2-Merkaptoetanol	Yaşam Teknolojileri Avustralya Ticaret A.Ş.	21985023	hiç kimse
Anestezik gaz makinesi	Darvall Vet, Avustralya	Ürün Kodu: 2848	hiç kimse
Anti-CTLA-4	BioXcell, Amerika Birleşik Devletleri	BE0164	hiç kimse
Anti-PD-1	BioXcell, Amerika Birleşik Devletleri	BP0273	hiç kimse
Buprenorfin Hidroklorür Enjeksiyonu, 0.3mg/mL	RB sağlık UK Limited, Birleşik Krallık	55175	Reçete siparişi
Klorheksidin Cerrahi Ovma %4	Perigo Avustralya, Avustralya	CHL01449F(fırçalayın	hiç kimse
Fetal Sığır serumu	CellSera, Avustralya	AU-FBS-PG	hiç kimse
Forseps İnce 10,5 cm	Cerrahi ev, Batı Avustralya	CC74110	hiç kimse
Forseps İnce 12 cm Tırtıklı	Cerrahi ev, Batı Avustralya	CC74212	hiç kimse
Forseps Halsted 14 cm	Cerrahi ev, Batı Avustralya	CD01114	hiç kimse
Isıtma odası	Datesand Ltd, Birleşik Krallık	Mini Termal	hiç kimse
HEPES (1M)	Yaşam Teknolojileri Avustralya Ticaret A.Ş.	15630080	hiç kimse
İzofluran	Henry Schein Hayvan Sağlığı, Avustralya	Ürün Kodu: 29405	Reçete siparişi
Kayganlaştırıcı Göz Merhemi	Alcon	Yok	hiç kimse
Penisilin / streptomisin 1000X	Yaşam Teknolojileri Avustralya Ticaret A.Ş.	15140122	hiç kimse
Fosfat Tamponlu Çözelti 10x	Yaşam Teknolojileri Avustralya Ticaret A.Ş.	70013-032	hiç kimse
Refleks 7mm Klipsler	Able Scientific, Avustralya	AS59038	hiç kimse
Refleks 7mm Yara Klipsi Aplikatörü	Able Scientific, Avustralya	AS59036	hiç kimse
Refleks Yara Klipsi Sökücü	Able Scientific, Avustralya	AS59037	hiç kimse
Kemirgen Qube Anestezi Solunum Devresi	Darvall Vet, Avustralya	#7885	hiç kimse
Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 Orta + L-glutamin	Yaşam Teknolojileri Avustralya Ticaret A.Ş.	21870092	hiç kimse
Makas İris STR 11 cm	Cerrahi ev, Batı Avustralya	KF3211	hiç kimse
Makas İris STR 9 cm	Cerrahi ev, Batı Avustralya	JH4209	hiç kimse
Küçük İndüksiyon Odası	Darvall Vet, Avustralya	Ürün Kodu: 9630	hiç kimse
TripLE ekspres 1x	Yaşam Teknolojileri Avustralya Ticaret A.Ş.	12604-021	hiç kimse