Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Donör insan derisi örneğinin işlenmesi
>NOT: Bu nakilde kullanılan insan derisi örneği, sağlıklı bir hastanın karnından alınan büyük bir örnekti. Numune en az 15 cm x 7,5 cm olmalıdır. Boyut sınırlamaları, cildin mevcut olduğu fare sayısını ve greft boyutu seçimini etkileyebilir.
- Hazırlama ve aşılamadan önce deri örneğini soğuk sıcaklıklarda (buz üzerinde; 4°C) koruyun. Numuneyi, fosfat tamponlu tuzlu suya (PBS) batırılmış gazlı bezle kapalı bir numune toplama kabında nemli tutun.
NOT: Cilt örneğinin 4 °C'de 2 günden daha uzun süre saklanması önerilmez. Bununla birlikte, cilt örneklerinin daha uzun süre saklandığı raporlar mevcuttur.
Dikkat: Tüm insan dokusunu standart biyolojik tehlike önlemleriyle tedavi edin.
- İnsan derisi örneğini, sterilize edilmiş bir diseksiyon tahtası üzerinde sterilize edilmiş bir negatif basınçlı doku kültürü başlığında dermatomlamaya hazırlayın.
- Deri örneğini epidermis tarafı yukarı bakacak şekilde diseksiyon tahtasına yerleştirin. Epidermisi steril bir alkol hazırlama pedi ve ardından PBS ile silin.
- Derinin daha yakın kenarını 1.5 inçlik bir diseksiyon T-pimi ile yerine sabitleyin (Malzeme Tablosuna bakın).
- Deri örneğini 400 μm kalınlığında dermatom yapın, 30 ° -45 ° açıyla ileri doğru keserken sabit basınç uygulayın. Cihaza özel tüm talimatlara ve güvenlik önlemlerine uyun (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Dermatom tekniği ile ilgili ayrıntılar için lütfen daha önce yayınlanmış bir rapora bakınız.
- Tabağın dibine steril PBS'ye batırılmış steril bir gazlı bez yerleştirerek 100 mm x 20 mm'lik bir Petri kabı hazırlayın. Cildi, epidermis tarafı yukarı bakacak şekilde ıslak gazlı bezin üzerine yerleştirin.
- Numunenin kontamine olmadığından emin olmak için plaka kenarlarını yarı saydam bir sızdırmazlık filmi ile kapatın ve kapatın (Malzeme Tablosuna bakın). Aşılamadan önce numuneyi 4 ° C'de saklayın.
2. Ameliyat öncesi kondisyon ve hazırlık
- Greftleme için steril aletleri ve steril bir cerrahi istasyonu hazırlayın. Alet ve fare yerleşimi için steril yüzeyler olarak otoklavlanmış kağıt havlular kullanın.
NOT: Fareler sütten kesildikten sonra aşılanabilir, ancak tercihen 8-10 haftalıkken aşılanır. Her iki cinsiyetten fareler aşılanabilir.
- Epilasyon gibi cerrahi hazırlığı, cerrahi istasyondan fiziksel olarak ayrılmış bir alanda gerçekleştirin.
- Anti-GR1'i (Malzeme Tablosuna bakınız) steril tuzlu su içinde 1 mg / mL'ye seyrelterek hazırlayın. Anestezi indüksiyonunu takiben her fareye intraperitoneal olarak 100 μg / 100 μL anti-GR1 solüsyonu dozlayın.
- Fareleri teker teker izofluran veya diğer kurumsal olarak onaylanmış anesteziklerle uyuşturun.
NOT: İzofluranın indüksiyon sırasında% 3 -% 5 konsantrasyonda verilmesi gerekir. Fare hareketsiz kaldığında, ameliyat süresini etkilemek için izofluran konsantrasyonunu %1-3'e düşürün.
- Solunum hızını, ayak parmağını sıkıştırma tepkisinin olmadığını ve kulakların ve ağzın uygun pembe renklenmesini gözlemleyerek fareyi uygun anestezi derinliği için izleyin.
Dikkat: Uygun anestezik makine ve süpürme yöntemleri kullanın ve izofluran buharlarına maruz kalmaktan kaçının.
- Fareyi bir ısıtma yastığına veya başka bir ısı kaynağına aktarın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Eldivenli bir parmağınızla göze küçük bir damla merhem sürerek oftalmik merhem uygulayın.
- Analjezikler Buprenorfin (0.08 mg / kg) ve Carprofen (5 mg / kg) (Materyal Tablosuna bakınız) cildi sıkıştırarak ve vücuda paralel bir açıyla enjekte ederek deri altına uygulayın.
NOT: Tedavi öncesi analjezi kurumsal protokollere uygun olarak hazırlayınız. Analjeziklerin seçimi ve uygulanması için kurumsal yönergeleri izleyin. Bu çalışmada kullanılan analjezi yöntemi adım 2.7 ve Şekil 1'de özetlenmiştir.
- Anti-GR1'i (adım 2.4'te hazırlanır) fareyi kuyruğundan hafifçe kaldırarak, karnı açığa çıkararak ve insülin 1 mL (12.7 mm) şırınga kullanarak 30 ° 'lik bir açıyla enjekte ederek intraperitoneal olarak uygulayın.
- Farenin sırt tarafının orta ve üst kısımlarını tıraş etmek için hayvanlar için güvenli elektrikli makaslar kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
- Tüm tüyleri temizleyin ve traş edilmiş cilde 30 saniye ila 1 dakika boyunca bol miktarda tüy dökücü merhem sürün.
- Epilasyon merhemini bir kağıt havlu ve PBS ile tamamen silin.
>3. Transplantasyon prosedürü
- Fareyi epilasyon istasyonundan uzakta, ikincil bir cerrahi konuma aktarın.
- Ameliyat bölgesini iyot çubukla dairesel hareketlerle, ortadan başlayarak ve epilasyonun alındığı alanın kenarına doğru ilerleyerek sterilize edin.
- Farenin üzerine bir parça steril plastik sargı yerleştirin ve plastikte aşılanacak alanın boyutundan biraz daha büyük bir pencere açın.
- Bir neşter ile aşılanacak dikdörtgen şeklinde 10 mm x 10 mm'lik bir donör derisi kısmı kesin. Bunu, donör cildini forsepsin arka tarafı ile sıkıca yerinde tutarak ve neşter ile forseps boyunca keserek yapın.
- Cerrahi makası kullanarak, donör deri parçasının boyutuna uygun dikdörtgen bir fare derisi alanını kesin ve bir greft yatağı oluşturun. Cildi vücuttan uzaklaştırmak için forseps kullanın ve yüzün derinlemesine kesilmesini önlemek için cildi makasla vücuttan uzağa açılı olarak kesin.
- Donör deri parçasını, epidermis tarafı yukarı bakacak şekilde hazırlanan greft yatağına yerleştirin.
- Forsepsin arkasını kullanarak cildi manipüle edin, donör cilt greft yatağına tamamen düz bir şekilde uzanana kadar ileri geri kaydırın.
- Donör derisinin fare derisiyle buluştuğu yere cerrahi yapıştırıcı doku yapıştırıcısı damlaları ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve yapıştırıcının dokulara yapışması için fareyi ve donör derisini forseps ile 1-2 saniye bir arada tutun. Greftin kenarını tamamen kapatın ve yapıştırıcının tamamen kurumasını bekleyin.
- Aşağıdaki adımları izleyerek fareleri (Şekil 2) sarın.
- Greft alanını tamamen kaplayacak kadar büyük bir vazelin gazlı bez parçası kesin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Grefti vazelin gazlı bezle örtün ve gazlı bezi forseps kullanarak cilde hafifçe bastırın.
- Şeffaf bir film sargısından bir şeridi uzunlamasına kesin, böylece genişlik farenin yarasını kaplayacak kadar büyük olur.
- Şeffaf film sargısını, yapışkan tarafı aşağı bakacak şekilde gazlı bezin üzerine sıkıca bastırın. Pansumanı gövdenin etrafına tamamen sarmak için fareyi hızla yuvarlayın, solunumu engellemeden sıkıca oturduğundan ve tüm uzuvların hareket için serbest olduğundan emin olun.
- Fareyi bir kurtarma kafesine yerleştirin ve uyanık olana ve hareket edene kadar izleyin. Kurtarma işleminden sonra en az 15 dakika boyunca kafesin bir kısmında bir ısı kaynağı sağlayın.
NOT: Hayvanların kurtarma kafesine yerleştirildikten sonra 1-5 dakika içinde iyileşmeleri beklenir.
