Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. İnsan PBMC tabanlı modelin kurulması
- NOD / SCID farelerinin siklofosfamid kullanılarak miyeloablasyonu: optimal dozların belirlenmesi
- Kadın obez olmayan diyabetik / şiddetli kombine immün yetmezlik (NOD / SCID) fareleri satın alın (6-8 hafta).
not: Bu çalışmada yer alan tüm fareler dişiydi.
- Salin içinde farklı dozlarda (50, 100 ve 150 mg / kg) siklofosfamid (CP) hazırlayın. Disülfiram (DS) 125 mg / kg.
'da tuzlu su içinde% 0.8 Tween-80 içinde hazırlayın
NOT: Farklı dozlarda CP alan farelere eşit hacimlerde ilaç çözeltisinin uygulanmasını sağlamak için farklı CP konsantrasyonları hazırlanmıştır.
- Hayvanları 2 gün boyunca günde bir kez CP (intraperitoneal, i.p.) ve DS (peroral, p.o.) ile tedavi edin. Her CP.
dozundan sonra DS (po.) verin
NOT: DS, farelerde CP'nin ürotoksisitesini azaltır ve DS ile kombine edilen CP'nin, tek başına CP ile tedavi edilen hayvanlardan daha uzun süreli nötropeniye sahip olduğu öne sürülmüştür. CP'nin doz rejiminin gerçek çalışmalardan önce önceden belirlenmesi gerekebilir ve farklı immün yetmezliği olan fare suşları arasında biraz farklılık gösterdiği bulunmuştur.
- Orbital venöz sinüsten kan örnekleri toplayın ve 0. günde (1. dozdan 1 saat önce), 2. günde (2. dozdan 24 saat sonra) ve 4. günde (2. dozdan 72 saat sonra) buz üzerinde potasyum etilendiamintetraasetik asit (EDTA-K) kaplı tüplere aktarın
.
- Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile CP ve DS tedavisinden sonra miyeloablasyon etkisini inceleyin. CD11b + Ly6C'yi nötrofiller kadaryüksek, CD11b + Ly6C'yi monositler kadaryüksek tutmak için sıçan anti-fare CD11b (M1 / 70), sıçan anti-fare Ly6C (HK1.4) ve sıçan anti-fare Ly6G (1A8) kullanın.
- Farelerin vücut ağırlığını ve sağlık koşullarını bir hafta boyunca günlük olarak kaydedin. Optimal CP ve DS dozu, farelerde ciddi toksisiteye neden olmadan nötrofillerin ve monositlerin maksimum tükenmesiyle sonuçlanan rejim olarak belirlenir.
- İnsan PBMC transplantasyonu ve tümör aşılaması: model kurulumu
- Üreticinin talimatlarına göre yoğunluk gradyan santrifüjleme ile insan PBMC'lerini sağlıklı donörlerden izole edin.
- Transplantasyon verimliliğini artırmak için fareleri adım 1.1.2 ve 1.1.3'te belirtildiği gibi CP ve DS ile ön işlemden geçirin.
- İkinci CP ve DS dozundan 20 ila 24 saat sonra, A431 hücreleri (ATCC, 2.5 x 106) ve 5 x 106 izole PBMC'ler (toplam 200 μL fosfat tamponlu salin (PBS)% 50 Matrigel içeren) veya tümör parçaları (3 x 3 x 3 mm3, % 50 Matrigel içeren toplam 200 μL PBS hacminde) ve 200 μL 5 x 106 PBMC (aşılanmış tümör fragmanının sol ve sağ tarafına 100 μL) subkutan olarak (s.c.) hayvanların sağ kanadı.
- Primer tümör hacmini ölçün ve 4-6 hafta boyunca haftada iki kez kaydedin.
not: Fareler, vücut ağırlıkları %20'den fazla kaybettiğinde veya tümör hacmi 2.000mm3'e ulaştığında veya tümör ülsere olduğunda ötenazi uygulanacaktır.
- Fareleri gaz odalarında karbondioksit ile ötenazi yapın. Kurban edilen farelerdeki tüm tümör dokularını oftalmik makasla toplayın ve bunları histoloji ve immünohistokimya (IHC) analizi için işleyin. Bu dokulardaki İnsan CD8, PD-1 ve PD-L1 ekspresyonlarını inceleyin.
