Herpes Simpleks Virüsü ile Enfekte İmmatür Dendritik Hücrelerde Otofajinin siRNA Bazlı İnhibisyonu

Özet

Kaynak: Düthorn, A., et al. siRNA Elektroporasyonu. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, otofajik akıya müdahale etmek için küçük bir enterferans yapan RNA (siRNA) tabanlı tekniği göstermektedir. FIP200 mRNA'yı hedefleyen bir siRNA, elektroporasyon kullanılarak monosit türevli olgunlaşmamış dendritik hücrelere (iDC'ler) sokulur, bu da FIP200 ekspresyonunun yıkılmasına neden olur ve otofaji yoluyla nükleer lamin bozulmasının inhibisyonuna yol açar. Herpes simpleks virüsü (HSV) eklendikten sonra, otofajik akı yoluyla lamin bozulmasının olmaması nedeniyle viral döllerin nükleer çıkışı inhibe edilir.

Protokol

Monosit türevi DC'ler, sağlıklı donörlerin lökoferez ürünlerinden üretildi. Bunun için yerel etik kuruldan olumlu oy alınmıştır (referans numarası 4556). Bu çalışmanın deneyleri, "Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg" (referans numarası 4556) etik komitesinin tavsiyelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm bağışçılar, Helsinki Bildirgesi'ne uygunluk da dahil olmak üzere yazılı bir bilgilendirilmiş onayı onayladılar.

1. Olgunlaşmamış dendritik hücrelerin (iDC'ler) ve olgun dendritik hücrelerin (mDC'ler) üretilmesi ve işlenmesi

1. İnsan periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) daha önce tarif edildiği gibi lökoredüksiyon sistem odalarından (LRSC'ler) izole edin. PBMC'lerin dondurularak saklanmasından kaçının ve daha yüksek DC verimleri elde etmek için bunları doğrudan izolasyon üzerine kullanın.
2. Daha önce açıklandığı gibi T175 hücre kültürü şişelerinde farklı sağlıklı donörlerin PBMC'lerinden insan DC'leri oluşturun. Kısaca, 30 mL DC ortamında 350-400 milyon PBMC kullanın (L-glutamin içermeyen RPMI 1640, %1 (h/h) İnsan Serumu Tip AB (AB-serum), 100 U/mL penisilin, 100 mg/mL streptomisin, 0.4 mM L-glutamin, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES)) monositlerin yapışma yoluyla izolasyonu için hücre kültürü şişesi başına. 1 saat sonra, yapışmayan fraksiyonu RPMI 1640 kullanarak yıkayın. 800 U/mL granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ve 250 U/mL interlökin-4 (IL-4) ile takviye edilmiş taze DC ortamı ekleyin ve 3 gün inkübe edin.
   1. Yapışmadan sonraki 3. günde, DC farklılaşması için hücre kültürü şişesi başına sırasıyla 400 U/mL ve 250 U/mL nihai konsantrasyona sahip GM-CSF ve IL-4 içeren 5 mL taze DC ortamı ekleyin.
   2. İDC'leri hasat etmek için, yapışmadan sonraki 4. günde, hücre kültürü şişesinin altından gevşek bir şekilde yapışan iDC'leri nazikçe durulayın. Bu adımı 2 kez tekrarlayın. mDC'lerin üretilmesi için, aşağıdaki gibi oluşan olgunlaşma kokteyli ekleyin: GM-CSF (nihai konsantrasyon: 40 U / mL), IL-4 (son konsantrasyon: 250 U / mL), interlökin-6 (IL-6, son konsantrasyon: 1000 U / mL), İnterlökin-1 beta (IL-1β, son konsantrasyon: 200 U / mL), Tümör Nekroz Faktörü alfa (TNF-α, son konsantrasyon: 10 ng / mL), prostaglandin E2 (PGE2; son konsantrasyon: 1 μg / mL).
   3. Yapışmadan altı gün sonra (bir sitokin kokteyli kullanılarak olgunlaşma indüksiyonundan iki gün sonra), mDC'leri hücre kültürü şişesinin altından durulayın. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
      not: Olgunlaşmamış ve olgun DC'ler, 1 hücre kültürü şişesindeki aynı donörlerden sırayla üretilebilir. Bunu yapmak için, (i) uygun sayıda iDC'yi ayırın ve (ii) adım 1.2.2'de listelenen sitokin kokteylini kullanarak şişelerde kalan hücrelerin olgunlaşmasını indükleyin.
3. İlgili hücre kültürü ortamındaki iDC'leri veya mDC'leri 50 mL'lik tüplere aktarın. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme yoluyla hasat edin.
   1. DC'leri hücre kültürü şişesi başına 5-10 mL RPMI 1640'ta nazikçe yeniden süspanse edin (= yıkayın). İlgili DC süspansiyonlarını tek bir tüpte birleştirin.
   2. Bir sayma odası veya alternatif bir yöntem kullanarak hücre numarasını tanımlayın. Fenotipik değişiklik riskini azaltmak için iDC'leri kullanırken sıcaklık değişikliklerinden kaçının.

>2. Fenotipik olgunlaşma durumunu izlemek için akış sitometrik analizleri

1. iDC'leri veya mDC'leri (0.5 x 10⁶) adım 1.3.1'den 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücreleri 1,5 dakika boyunca 3390 x g'da santrifüjleme yoluyla hasat edin. Hücreleri bir kez FACS tamponu ile yıkayın (PBS% 2 fetal buzağı serumu (FCS) ile desteklenmiş).
2. Hücreleri, tanımlanmış yüzey moleküllerine karşı spesifik florokrom etiketli antikorlar içeren 100 μL antikor boyama çözeltisinde (FACS tamponu) yeniden süspanse edin.
   1. Saflığı doğrulamak için aşağıdaki antikorları kullanın (CD3-floresein izotiyosiyanat [FITC], CD14-fikoeritrin [PE]) ve ayrıca DC'lerin olgunlaşma durumunu (CD80-PacBlue [Pasifik Mavisi] / -PE-siyanin5 [Cy5], CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7).
   2. Kontrol olarak 100 μL FACS tamponunda boyanmamış bir numune hazırlayın.
   3. Hücreleri karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde boyayın.
3. Daha sonra, hücreleri 1 mL FACS tamponunda iki kez yıkayın ve 3390 x g'da 1.5 dakika santrifüjleyin.
4. Son olarak, hücreleri %2 paraformaldehit (PFA) ile desteklenmiş 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin. Sabit hücreler karanlıkta 4°C'de 2 güne kadar saklanabilir.

3. FIP200-siRNA kullanılarak iDC'lerin elektroporasyonu yoluyla HSV-1'in neden olduğu otofajik akının girişimi

NOT: siRNA elektroporasyonu için mevcut protokol Prechtel ve ark. (2007) ve Gerer ve ark. (2017).

1. Yapışmadan sonraki 3.5. günde iDC'leri (12 x 10⁶) 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Daha sonra, hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Paralel olarak, 2. adımda açıklandığı gibi olgunlaşma durumunu izlemek için akış sitometrik analizi yapın (CD80-PacBlue yerine Life/Dead violet kullanın).
2. iDC'leri fenol kırmızısı olmadan 5 mL OptiMEM'de nazikçe yıkayın ve hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve iDC'leri fenol kırmızısı içermeyen 200 μL OptiMEM içinde nazikçe yeniden süspanse edin ve 6 x 10⁶/100 μL'lik bir hücre konsantrasyonunu ayarlayın. Hücreleri buzun üzerine koymayın ve sıcaklık değişikliklerinden kaçının. Hızlı bir şekilde ilerleyin ve fenol kırmızısı içermeyen OptiMEM'de iDC'lerin uzun kuluçka dönemlerinden kaçının.
3. Kontrol olarak 75 pmol FIP200'e özgü siRNA veya 75 pmol karıştırılmış siRNA'yı 4 mm'lik elektro küvetlere aktarın ve 100 μL (6x10⁶ hücre) hücre süspansiyonu ekleyin. Aşağıdaki ayarları uygulayarak elektroporasyon aparatı I'i kullanarak iDC'leri doğrudan darbeleyin: 1 ms için 500 V.
   1. Deneysel prosedürden önce, siRNA süspansiyonlarını üreticinin talimatına göre hazırlayın, ayırın ve -20 °C'de saklayın. Bu siRNA'ları elektroporasyon için kullanırken çözün ve buz üzerinde tutun. Numuneleri elektropolamadan önce bir test darbesi gerçekleştirin.
4. Elektroporasyondan sonra, iDC'yi önceden ısıtılmış taze DC ortamı (40 U/mL GM-CSF ve 250 U/mL IL-4 ile desteklenmiş) ile doğrudan 6 oyuklu plakalara aktarın. Hücreleri 1 x 10⁶ / mL'lik bir son konsantrasyonda tohumlayın ve bir inkübatöre yerleştirin. Hücreleri elektro küvetten durulamayın.
5. 48 saat sonra, önce elektroporasyonlu iDC'lerin morfolojisini mikroskobik olarak inceleyin. Daha sonra, hücreleri bir hücre sıyırıcı kullanarak toplayın ve bunları 15 mL'lik tüplere aktarın. Kuyucukları% 0.01 etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile desteklenmiş 1 mL PBS ile durulayın ve çözeltiyi ilgili tüplere aktarın.
6. Ardından, sonraki adımlarda açıklandığı gibi siRNA koşulu başına 6 x 10⁶ iDC'yi bölün.
   1. Adım 2'de açıklandığı gibi olgunlaşma durumunu ve hücre canlılığını değerlendirmek için 0,5 x 10⁶ hücre kullanın. Aşağıdaki antikorları kullanın: CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 ve Life/Dead violet.
   2. FIP200'e özgü knockdown verimliliğini doğrulamak için Western blot analizleri için 1 x 10⁶ hücre kullanın. Hücreleri, 1.5 dakika boyunca 3390 x g'da santrifüjleme yoluyla 1.5 mL'lik bir güvenli kilit tüpüne aktarın ve hasat edin. Hücre lizatları hazırlayın ve Western blot analizleri yapın.
   3. HSV-1 enfeksiyon deneyleri için kalan hücreleri (4,5 x 10⁶) kullanın. Her deneysel koşul için, 2.25 x 10⁶ iDC'yi 2 mL'lik tüplere aktarın ve bunları 2'lik bir enfeksiyon çokluğunda (MOI) HSV1 ile enfekte edin veya sahte bir kontrol olarak MNT tamponu ekleyin. Enfeksiyonu açıklandığı gibi gerçekleştirin.
   4. Enfeksiyondan 20 saat sonra (hpi), hücreleri bir hücre kazıyıcı kullanarak toplayın ve Western blot analizleri için hücre lizatları hazırlayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
4D-Nükleofektör Çekirdek Ünitesi (elektroporasyon aparatı II)	Lonza (Basel, İsviçre)	AAF-1002B
AB-Serumu	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Almanya)	H4522	Dendritik hücre yetiştiriciliği
ACD-A	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Almanya)	9007281
Amaxa P3 Birincil Hücre 4D-Nükleofektör X Kiti L (elektroporasyon kiti aparatı II)	Lonza (Basel, İsviçre)	V4XP-3024
Amersham ECL Prime Western Blotting Tespit Reaktifi	GE Sağlık (Solingen, Almanya)	RPN2232	Western Blot Tespiti
Amonyum persülfat (APS)	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Almanya)	A3678
anti-fare-IgG (fare, poliklonal, HRP)	Hücre Sinyalizasyonu (Leiden, Hollanda)	7076	Western Blot tespiti
anti-tavşan-IgG (keçi, poliklonal, HRP)	Hücre Sinyalizasyonu (Leiden, Hollanda)	7074	Western Blot tespiti
BD FACS Canto II Akış Sitometresi	BD Biosciences (Heidelberg, Almanya)	338962
Kurutma Odası Fastblot B44	Biometra (Göttingen, Almanya)	846-015-100
CCR7 (fare, Pe-Cy7)	BioLegend (Fell, Almanya)	557648	Akış sitometrisi Seyreltme: 1:100 Klon: G043H7
CD11c (fare, Pe-Cy5)	BD Biosciences (Heidelberg, Almanya)	561692	Akış sitometrisi Seyreltme: 1:100 Klon: B-ly6
CD14 (fare, PE)	BD Biosciences (Heidelberg, Almanya)	555398	Akış sitometrisi Seyreltme: 1:100 Klon: M5E2
CD3 (fare, FITC)	BD Biosciences (Heidelberg, Almanya)	555332	Akış sitometrisi Seyreltme: 1:100 Klon: UCHT1
CD80 (fare, V450)	BD Biosciences (Heidelberg, Almanya)	560442	Akış sitometrisi Seyreltme: 1:100 Klon: L307.4
CD83 (fare, APC)	eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Almanya)	17-0839-41	Akış sitometrisi Seyreltme: 1:200 Klon: HB15e
CD86 (fare, PE)	BD Biosciences (Heidelberg, Almanya)	553692	Akış sitometrisi Seyreltme: 1:100
EVOS FL Hücre Görüntüleme	Sistem AMG/Yaşam Teknolojileri (Carlsbad, ABD)	AMF4300
FIP200 (tavşan)	Hücre Sinyalizasyonu (Leiden, Hollanda)	12436	Western Blot algılama Seyreltme: 1:1000 Klon: D10D11
Gen Pulser II aparatı (elektroporasyon aparatı I)	BioRad Laboratories GmbH (Münih, Almanya)	165-2112
GM-CSF (4x104 U/mL)	Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Almanya)	130-093-868
HLA-DR (fare, APC-Cy7)	BioLegend (Fell, Almanya)	307618	Akış sitometrisi Seyreltme: 1:200 Klon: L243
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43	BiyoVex		DC enfeksiyonu
IL-1β (0.1x106 U/mL)	Cell Genix GmbH (Freiburg, Almanya)	1411-050
IL-4 (1x106 U/mL)	Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Almanya)	130-093-924
IL-6 (1x106 U/mL)	Cell Genix GmbH (Freiburg, Almanya)	1404-050
Görüntü Quant LAS 4000	GE Sağlık (Solingen, Almanya)	28955810
L-glutamin	Lonza (Basel, İsviçre)	17-605E
CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Menekşe ölü hücre leke kiti	Yaşam Teknolojileri (Carlsbad, CA, ABD)	L34964	Flow sitometride L/D boyama
Lenforep	Alere Technologies AS (Oslo, Norveç)	04-03-9391/01
Magnezyum klorür	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Almanya)	A537.1
Megafüj 2.0 RS	Heraeus (Hanau, Almanya)	75015505
Neubauer sayma odası	Marka (Wertheim, Almanya)	717805
Nunc Hücre kültürü şişeleri (175.0 cm2)	Thermo Scientific (Rockford, ABD)	159910
Paraformaldehit, % 16	Alfa Aesar, Haverhill, Amerika Birleşik Devletleri	43368,9milyon
PerfectSpin 24 Artı	Peqlab (Erlangen, Almanya)	C2500-R-PL
PGE2 (1 mg / mL)	Pfizer (Berlin, Almanya)	BE130681
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Lonza (Basel, İsviçre)	17-512F
RestoreTM Western Blot Sıyırma Tamponu	Termo Bilimsel, Rockford, ABD	21059
Sallanan Platform wt 15	Biometra (Göttingen, Almanya)	042-590
RotiBlock	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Almanya)	A151.4
Roti-Yük 1 (4x)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Almanya)	K929.3
Rotiforoz Jel 30 (37.5:1)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Almanya)	3029.1
dev/dak 1640	Lonza (Basel, İsviçre)	12-167F
Sodyum dodesil Sülfat (SDS)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Almanya)	2326.2
Termomikser konforu	Eppendorf (Hamburg, Almanya)	5355 000.011
TNF-α (10 μg/mL)	Peprotech (Hamburg, Almanya)	300-01A
Tris	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Almanya)	4855.3
Tripan mavisi çözeltisi (% 0.4	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Almanya)	T8154
Ara 20	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Almanya)	9127.1
Whatman 0.2 μm nitroselüloz membran	GE Sağlık (Solingen, Almanya)	10600001
WhatmanTM Kromatografi Kağıdı 3 mm Chr	Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Almanya)	3030917

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi ) Serisi (İngilizce)