Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>1. Hayvanlar
- C57BL6/J dişi fareleri, mikro izolasyon filtreli ayrı ayrı havalandırılan kafeslerde 8 haftalık olana kadar büyütün.
NOT: Dişiler tercih edilir, çünkü dış ürogenital aparatlarının anatomik konformasyonu, kateterizasyonu erkeklere göre daha kolay hale getirir.
2. Hücre Kültürü
- Fare ürotelyal karsinom hücre hattı MB49'u, nemlendirilmiş% 5 karbon dioksit (CO2) içinde% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu ve 37 ° C'de 50 μg / ml gentamisin ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamında koruyun.
- T-49 şişelerindeki MB75 hücrelerini% 80 birleşmeye kadar büyütün. Farelerde implantasyondan önce 150 μl fosfat tamponlu salin (PBS) başına 0.5 ×10 5 - 0.5 ×10 6 hücrede tripsinize edin ve yeniden süspanse edin.
3. İntravezikal Tümör İmplantı
- Anestezik zoletil ve ksilor (sırasıyla 33 mg / kg ve 20 mg / kg) karışımı kullanılarak fareleri anestezize edin, intraperitoneal olarak enjekte edilir.
- Hayvanları sırtüstü pozisyona getirin ve arka ayakları bantla pede sabitleyin. Üretral meatusu iyi görünür ve kateter yerleştirilmesi için kolayca erişilebilir kılmak için pençeler yeterince ayrılmalıdır.
- NOT: Kateterizasyon için, 8 ila 10 haftalık fareler için 24 G pediatrik venöz kateter uygundur. Üretra duvarı ile kateter arasında sıvı sızıntısını önlemek için kateter seçimi kritik öneme sahiptir. Daha büyük veya daha yaşlı fareler için daha büyük delikli kateterler kullanılmalıdır.
- Küçük bir pense kullanarak, üretranın dış kısmının bir kenarını sıkıştırın ve farelerin "baş ucuna" doğru çok nazikçe bükün. Bu hareket üretral meatusu ortaya çıkarır.
- Kateterin iç iğnesini çıkarın ve ikincisini, farelerin "kuyruk ucuna" doğru hafifçe yönlendirilmiş olarak 45°'lik bir açıyla üretraya yerleştirin. Kateterin girişini zorlamayın; Direnç durumunda, kateteri üretranın içine girene kadar çok nazikçe çevirin. Kateterin yaklaşık 0.5-0.8 cm'si üretrada olduğunda, kateteri farelerin kuyruğuna paralel olarak dikkatlice yerleştirin ve tamamen yerleştirin.
- İğnesi katetere yerleştirilmesi gereken 1 ml'lik bir şırınga kullanarak, 200-300 μl steril PBS enjekte ederek mesaneyi artık idrardan yıkayın ve mesaneden tüm sıvıyı aspire edin.
- NOT: PBS enjekte edilirken, mesane dolacak ve farelerin arka bacakları arasında şişlik görülecektir; bu, kateterizasyonun doğru olduğunu doğrular. Çoğu kateter, enjeksiyon hacmi hesaplanırken dikkate alınması gereken ölü bir hacme sahiptir.
- Steril 1 ml'lik bir şırınga kullanarak 200 μl 0.1 N hidroklorik asit (HCl) enjekte edin. Tüm duvarını yakmak için mesaneyi doldurun. 10 saniye sonra, tüm asidi çıkarın ve steril bir şırınga ile 200 μl 0.1 N sodyum hidroksit (NaOH) enjekte ederek hemen nötralize edin. En yüksek sayıda hücrenin (0,5 × 106) enjeksiyonu durumunda, asitleştirme aşaması gerekli değildir.
- Kalan tüm sıvıyı aspire edin ve boşluğu hemen 300 μl steril PBS ile yıkayın.
- Mesaneyi aspirasyon ile boşaltın ve mesaneye MB49 hücreleri (aralık 0.5 × 105 - 0.5 × 106) içeren 150 μl PBS enjekte edin. Hücrelerin sızmasını önlemek için şırıngayı katetere monte edilmiş halde bırakın. Şırıngayı, bantla pede sabitleyerek sabitlemek daha iyidir.
- 1 saat sonra, kateteri üretradan nazikçe çıkarın ve fareleri uyanana kadar akkor lambanın altındaki kafese yerleştirin: bu genellikle tedavinin bitiminden 1 ila 2 saat sonra gerçekleşir.
4. Helicobacter pylori nötrofil aktive edici proteinin (HP-NAP) intravezikal iletimi
- NOT: Hücre damlatmasından en az 3 gün sonra tedaviye başlamak mümkündür.
- Adım 3.1 ila 3.4'te açıklandığı gibi kateterize edin. Bu aşamada mesane duvarını HCl ile yakmak gerekli değildir.
- 1 ml'lik bir şırınga kullanarak, 200-300 μl steril PBS enjekte ederek mesaneyi artık idrardan yıkayın ve mesaneden tüm sıvıyı aspire edin.
- Mesaneye 150 μl PBS başına 50 μg HP-NAP enjekte edin. Protein çözeltisinin sızmasını önlemek için şırıngayı katetere bağlı bırakın. Şırıngayı bantla pede sabitleyerek sabitleyin.
- 1 saat sonra, kateteri üretradan nazikçe çıkarın ve fareleri uyanana kadar akkor lambanın altındaki kafese yerleştirin.
