Viral Antijene Özgü T Hücreleri Kullanılarak Hepatit B Virüsü Replikasyonunun Baskılanması

Abstract

Kaynak: Xiong, X., et al. Kök Hücre Kaynaklı Viral Ag-Spesifik T Lenfositleri Farelerde HBV Replikasyonunu Baskılıyor. J. Vis. Exp. (2019).

Video, farelerde hepatit B virüsü (HBV) replikasyonunu inhibe etmek için insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) türevi CD8+ T hücrelerinin kullanıldığı bir testi göstermektedir. HBV'ye özgü reseptörlerle tasarlanan bu T hücreleri, transgenik farelere aktarılır. Replikasyona yetkin HBV genom plazmitleri daha sonra doğrudan karaciğere enjekte edilerek viral DNA alımını sağlar. Viral antijenler hibrid MHC-I molekülleri tarafından eksprese edilip sunulduğunda, tasarlanmış T hücreleri bu kompleksleri tanır ve bunlara bağlanır. Bu, sitotoksik moleküllerin salınımını tetikleyerek HBV ile enfekte karaciğer hücrelerinin yok olmasına ve viral replikasyonun baskılanmasına neden olur.

Protocol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler local
tarafından gözden geçirilmiştir kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu. Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. iPSC'lerden viral Ag'ye özgü CD8⁺ T hücrelerinin üretilmesi (iPSC-CD8⁺ T hücreleri)

1. Retroviral yapıların oluşturulması
   not: T hücresi reseptörü (TCR) α ve β genleri, 2A kendi kendine parçalanma dizisi ile bağlantılıdır. Retroviral vektör MSCV-IRES-DsRed (MiDR) DsRed+'dır.
   1. s183 MiDR yapısını oluşturm....

Results

Şekil 1: HBV viral Ag-spesifik iPSC-CD8⁺ T hücrelerinin üretimi.

Fare iPSC'leri aşağıdaki retroviral yapılarla dönüştürülür: HBs183-91 TCR (MiDR-s183 TCR) veya OVA257–264 TCR (MiDR-OVA TCR) ve transdüksiyonlu iPSC'ler, T soy farklılaşması için OP9-DL1/DL4 stromal hücrelerle birlikte kültürlenir. (A) S183'e özgü TCR'yi ifade eden retroviral yapı MiDR-s183 TCR'nin .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HHD fareler	Institut Pasteur, Paris, Fransa		H-2 sınıf I nakavt, HLA-A2.1-transgenik (HHD) fareler
iPS-MEF-NG-20D-17	RIKEN Hücre Bankası	APS0001
SNL76/7	ATCC (Uzay Servisi)	SCRC-1049
OP9	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-2749
pAAV/HBV1.2 plazmit	Dr. Pei-Jer Chen (Tayvan Ulusal Üniversite Hastanesi, Tayvan)		HBV DNA yapısı
HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-spesifik TCR genleri	Dr. Adam J Gehring (Toronto Genel Hastanesi Araştırma Enstitüsü, Toronto, Kanada)		FLLTRILTI'ye özgü A2 kısıtlı insan-murin hibrid TCR genleri (Vα34 ve Vβ28)
OVA257–264'e özgü TCR genleri	Dr. Dario A. Vignali (Pittsburgh Üniversitesi, PA)		SIINFEKL'e özgü H-2Kb kısıtlı TCR genleri
Anti-CD3 (17A2) antikoru	Biyoefsane	100236
Anti-CD44 (IM7) antikoru	BD Pharmingen	103012
Anti-CD4 (GK1.5) antikoru	Biyoefsane	100408
Anti-CD8 (53-6.7) antikoru	Biyoefsane	100732
Anti-IFN-γ (XMG1.2) antikoru	Biyoefsane	505810
Anti-TNF-a (MP6-XT22) antikoru	Biyoefsane	506306
α-MEM	Canlandırıcı	A10490-01
Anti-HBs antikoru	Termo Balıkçı	MA5-13059
ACK Lizis tamponu	Fransa	10-548E
Brefeldin A	Sigma	B7651
DMEM (Ömer Çiçeğ	Canlandırıcı	ABCD1234
FBS (FBS)	Klon	SH3007.01
FACSAria Füzyon hücre sıralayıcı	Bd	656700
jelatin	MilliporeSigma	G9391
Gen Karıştırıcı	Yaşlı	204130
HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer	Proimmün	F027-4A - 27
HRP Anti-Fare İkincil Antikoru	Canlandırıcı	A27025
mFlt-3L	Peprotech teknolojisi	250-31L
mIL-7	Peprotech teknolojisi	217-17
Nükleaz S7	Roche	10107921001
Paraformaldehit	MilliporeSigma	P6148-500G	Dikkat: Alerjenik, Kanserojen, Toksik
Geçirgenlik tamponu	Biyoefsane	421002
Polibren	MilliporeSigma	107689
ProLong™ DAPI ile Altın Antifade Mountant	Canlandırıcı	P36931 Serisi
QIAamp MinElute Virüsü Döndürme Kiti	Keçi	57704