$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler local
tarafından gözden geçirilmiştir
kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu. Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. iPSC'lerden viral Ag'ye özgü CD8+ T hücrelerinin üretilmesi (iPSC-CD8+ T hücreleri)
- Retroviral yapıların oluşturulması
not: T hücresi reseptörü (TCR) α ve β genleri, 2A kendi kendine parçalanma dizisi ile bağlantılıdır. Retroviral vektör MSCV-IRES-DsRed (MiDR) DsRed+'dır.
- s183 MiDR yapısını oluşturmak için HBs183-191 (FLLTRILTI) spesifik A2 kısıtlı insan-murin hibrit TCR (s183 TCR) genlerini (Vα34 ve Vβ28) MiDR'ye alt klonlayın (Şekil 1A).
- Retroviral transdüksiyon
NOT: Platin-E (Plat-E) hücreleri, retroviral transdüksiyon için kullanılacak olan retrovirüsleri (s183 TCR genlerini taşıyan) paketlemek için kullanılır. Plat-E hücreleri, gag, pol ve ekotropik env dahil olmak üzere retroviral yapı proteinini eksprese etmek için EF1α promotörü aracılığıyla benzersiz paketleme yapıları aracılığıyla geliştirilen 293T hücrelerinin altında yatan etkili retrovirüs paketleme hücreleridir.
- 100 mm'lik bir kültür kabında, transfeksiyondan 1 gün önce% 5 CO2 ile% 37 ° C'de bir inkübatörde% 10 fetal buzağı serumu (FCS) içeren% 10 fetal buzağı serumu (FCS) içeren 8 mL DMEM kültür ortamında 3 x 106 Plat-E hücresi tohumlayın.
- 0. günde, s183 MiDR yapısını bir DNA transfeksiyon reaktifi kullanarak Plat-E hücrelerine aktarın.
- 1. günde, 1 x 106 iPSC'yi (yeşil floresan proteini [GFP]+) jelatin önceden kaplanmış bir kültür plakasına tohumlayın.
- 2-3. günlerde, 1,6-dibromohekzan çözeltisi varlığında s183 TCR ile iPSC'leri transdüklemek için Plat-E hücre kültüründen retrovirüs içeren süpernatant toplayın.
- 4. günde, s183 TCR geni ile dönüştürülmüş iPSC'leri tripsize edin, 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin ve 3 x 106 ışınlanmış SNL76/7 (irSNL76/7) besleyici hücreleri ile önceden kaplanmış 100 mm'lik bir kültür kabında 3 × 105 iPSC'yi tohumlayın.
- Birleşmenin 5. veya 6. gününde, hücreleri tripsinize edin, 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin ve hücre sıralama işlemini gerçekleştirin. Canlı hücreler üzerinde geçitleme yaparak, yüksek hızlı bir hücre sıralayıcı kullanarak GFP ve DsRED çift pozitif hücreleri (s183 TCR geni ile dönüştürülmüş iPSC'ler) sıralayın. Adım 1.2.5'e benzer şekilde, sıralanmış hücreleri ileride kullanmak üzere irSNL76/7 besleyici hücrelerde birlikte kültürleyin.
- HBV'ye özgü iPSC-CD8 + T hücrelerinin farklılaşması
NOT: OP9-DL1 / DL4 stromal hücreleri, hem Notch ligandları DL1 hem de DL4'ü aşırı eksprese eder ve iPSC'lerin iPSC'lerle birlikte kültürlenmesi, Notch sinyal aracılı T hücresi farklılaşmasını teşvik edebilir.
- % 20 fetal sığır serumu (FBS) içeren minimum α esansiyel ortam (MEM) ortamında OP9-DL1-DL4 hücre tek tabakasında s183 TCR gen transdüksiyonlu iPSC'leri (s183 / iPSC'ler) büyütün. Kültüre murin FMS benzeri tirozin kinaz 3 (Flt3) ligandını (mFlt-3L; son konsantrasyon = 5 ng / mL) dahil edin.
- 0. günde, daha önce OP9-DL1-DL4 hücreleri ile yetiştirilmiş 10 cm'lik bir kültür kabına 0.5–1.0 x 105 S183/iPSC tohumlayın. OP9-DL1-DL4 hücrelerinin %80-90 birleşme durumunda olduğunu doğrulayın.
- 5. günde, iPSC'leri 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın, PBS'yi aspire edin, bunu 4 mL% 0.25 tripsine ekleyin ve 37 ° C'lik bir inkübatörde 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, tripsin sindirimini sonlandırmak için ek bir 8 mL iPSC ortamı ekleyin. Hücreleri içeren tüm sindirim solüsyonlarını biriktirin ve 15-30 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 10 mL iPSC ortamında yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu yeni bir 10 cm'lik Petri plakasına aktarın ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca bir inkübatörde inkübe edin.
- 30 dakika sonra, yüzen hücreleri içeren iPSC ortamını toplayın. Hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin ve hücre sayısını hesaplayın.
- Kültür kabındaki 5 x 105 hücreyi, adım 1.3.1.
'de açıklandığı gibi, %80-%90 birleşik durumla daha önce yetiştirilmiş OP9-DL1-DL4 hücreleri
not: T hücresi farklılaşması için, her 2-3 günde bir, iPSC'den türetilmiş hücrelerin OP9-DL1-DL4 hücrelerinin taze bir tabakası ile yeniden tohumlanması gerekir.
- değerlendirme
- Farklılaşan iPSC'lerin morfolojik değişimleri
- Hücreleri çeşitli günlerde mikroskop altında gözlemleyin.
not: 5. günde, koloniler mezoderm benzeri özelliklere sahiptir, insan dermal fibroblastlarına benzeyen klasik iğ şeklinde bir morfoloji sergiler ve in vitro olarak sürekli büyüme gösterir. 8. günde, küçük yuvarlak hücre kümeleri ortaya çıkmaya başlar.
- Akış sitometrisi ile ayırt edici iPSC'lerin analizi
- Ko-kültürün çeşitli günlerinde, iPSC'den türetilmiş hücreleri daha önce tarif edildiği gibi analiz edin (Şekil 1B, C).
- Farklılaşan iPSC'lerin fonksiyonel analizi
- Ko-kültürün 28. gününde, yüzen hücreleri hasat ederek kültürlerden iPSC-CD8 + T hücrelerini toplayın, kalan hücreleri% 0.25 tripsin ile tripsinize edin, 8 mL iPSC ortamında yeniden süspanse edin, 15-30 ° C'de 400 x g'de 5 dakika santrifüjleyin, ortamı çıkarın, ardından hücreleri 10 mL ortamda yeniden süspanse edin.
- Yeniden askıya alınan hücreleri 10 cm'lik taze bir tabakta 37 °C'lik bir inkübatörde 30 dakika tutun ve yüzen hücreleri birleştirin. Ardından hücreleri bir kez soğuk bir PBS ile durulayın.
- H-2 sınıf I nakavt dalaklarından, HLA-A2.1-transgenik (HHD) farelerden 3 x 106 T hücresi tükenmiş splenositleri (CD4-CD8-) 5 μM s183 peptid (FLLTRILTI) ile 200 μL ortamda 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- S183 peptidi ile darbeli splenositler ile iPSC-CD8 + T hücrelerinin bir karışımını üretin (T hücreleri: splenositler = 1: 4; 0.75 x 106 T hücreleri kullanın). Hücre karışımını 37 ° C'de bir CO2 inkübatöründe 40 saat inkübe edin. Son 7 saat boyunca, hücre aktivasyonu sırasında taşıma işlemlerini bloke etmek için kültüre 4 μL seyreltilmiş brefeldin A ekleyin (1,000x kültür ortamında seyreltilecek olan 1,000x'lik nihai konsantrasyon).
- Hücreleri boyayın ve daha önce tarif edildiği gibi hücre içi İnterferon-gama (IFN-γ) akış sitometrik analizini yapın (Şekil 2).
2. HBV plazmidinin hidrodinamik iletimi yoluyla HBV replikasyonunun indüksiyonu
>NOT: pAAV/HBV1.2 yapısı daha önce açıklandığı gibi oluşturulmuştur. HBV 1.2 tam DNA, pAAV vektörüne dahil edilmiştir.
- HBV plazmidinin kuyruk damarı yoluyla hidrodinamik iletimleri
- Kuyruk damarını genişletmek için HHD farelerini kafeste 5 dakika boyunca bir ısı lambası kullanarak ısıtın.
- Hayvanı bir sınırlayıcı vasıtasıyla alıkoyun ve fare kuyruklarını% 70 etanol sprey ile temizleyin.
- Plazmidin karaciğere verilmesi.
- Bir ölçüm ölçeği kullanarak farenin vücut ağırlığını ölçün.
- Vücut kütlesi PBS'nin% 8'ine eşdeğer olarak 10 μg HBV plazmitini seyreltin (ör., 20 g'lık bir fare için 1.6 mL). Seyreltilmiş plazmiti 3 mL'lik bir şırıngaya 26 G × 1⁄2" (0.45 × 12 mm) hipodermik iğne ile yükleyin.
- Kuyruğun orta üçte birlik kısmındaki iki yan kuyruk damarından birini bulun ve iğneyi her iki yan damara yerleştirin. HBV plazmid içeren enjeksiyonu 3-5 saniye içinde kuyruk damarından uygulayın.
- Enfekte farelerin kan serumundan viremi miktarının belirlenmesi
not: HBV replikasyonu, fare serumunda 3-35. gün arasında gerçekleşir. DNA replikasyonu 7. günde zirve yapar ve yavaş yavaş azalır. HBV DNA'sı 35. güne kadar serumdan temizlenmez.
- Enfekte farelerden kan serumu toplanması
- Enfeksiyondan 3, 5, 7 ve 10 gün sonra 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde retroorbital kanama ile her fareden bir mikrosantrifüj tüpünde yaklaşık 0.1 mL kan toplayın, daha sonra oda sıcaklığında (RT) 20 dakika inkübe edin.
- Numuneyi 4 ° C'de 15 dakika boyunca 6.000 x g'da santrifüjleyin ve santrifüjlemeden sonra serum süpernatantını toplayın.
- Üreticinin tavsiyelerine uygun olarak ticari olarak temin edilebilen bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak DNA'yı kan serumundan saflaştırın. Kısaca silika bazlı bir kolonda hücreleri parçalayın, yıkamaları gerçekleştirin ve elüsyon kolonuna %100 etanol ekleyerek ve 1 dakika boyunca 6000 x g'da santrifüjleyerek DNA'yı çıkarın. DNA'yı 50 μL RNaz içermeyen suda elute edin.
- Gerçek zamanlı PCR analizi için elüsyondan 100 ng HBV DNA kullanın. Aşağıdaki astarları ve probları kullanın: ileri 5' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3'; ters 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3'; sonda 5' TCACCTCTGCCTAATC 3'.
- Standart eğri için plazmit (pAAV/HBV1.2) içeren HBV genomunu kullanın ve toplam 10 μL hacimde gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin (Şekil 3).
- PCR reaksiyonunu Tablo 10'de gösterildiği gibi toplam 1 μL'lik bir hacimde ayarlayın.
- PCR programını Tablo 2'de gösterildiği gibi termocycler'da kurun. Programlanan sıcaklık geçiş hızı, denatürasyon/tavlama için 20 °C/sn ve uzatma için 5 °C/s'dir. Gerçek zamanlı PCR izlemesi için her döngü için tavlama aşamasının sonundaki floresansı ölçün.
>3. Viral Ag-spesifik iPSC-CD8 + T hücrelerinin ACT ile HBV replikasyonunun azaltılması
- Evlat edinen hücre transferi (ACT)
- Bölüm 1.3.7'te açıklandığı gibi, 8 gün boyunca mFlt-3L ve mIL-7 varlığında OP9-DL1-DL4 stromal hücreleri üzerinde s1.3/iPSC'leri (1.3) ayırt edin.
- 22. günde, iPSC-CD8 + T hücrelerini tripsin içeren 10 cm'lik plakadan toplayın, ardından her 10 cm'lik plakayı 10 mL taze ortamda yıkayın ve yeniden süspanse edin. Hücreleri 10 cm'lik yeni bir tabağa ekleyin ve bölüm 1.3'te yapıldığı gibi 30 dakika inkübatöre geri dönün. 30 dakika sonra yüzen hücreleri toplayın.
- Hücre kümelerini ortadan kaldırmak ve hücre sayısını saymak için hücreleri geçirmek için 70 μm'lik bir naylon süzgeç kullanın. Hücreleri soğuk PBS çözeltisinde 1.5 x 107 hücre / mL konsantrasyona uyarlayın ve gerekirse hücre kümelerini tekrar ortadan kaldırmak için hücreleri geçirmek için 70 μm'lik bir naylon süzgeç kullanın. ACT'ye kadar hücreleri buz üzerinde tutun.
- 200 μL hücre süspansiyonu (3 x 106 hücre) kuyruk damarı yoluyla 4-6 haftalık HHD farelerine enjekte edin.
- HBV replikasyonunun indüksiyonu
- Hücre transferinden sonraki 14. günde, bölüm 2.1'de tarif edildiği gibi HBV plazmidinin kuyruk damarı yoluyla hidrodinamik iletimini gerçekleştirin.
Tablo 1: PCR reaksiyon hacmi
| DNA şablonu | 2 ml |
| DNA ana hibridizasyon karışımı ((Taq DNA polimeraz, PCR reaksiyon tamponu, 10 mMMgCl2 ve dNTP karışımı) | 1 ml |
| 25 mM MgCl2 | 0,8 ml |
| 0.3 μM prob | 3 ml |
| Her astarın 5 μM'si | 3,2 ml |
| toplam | 10 ml |
Tablo 2: PCR programı
| denatürasyon | Sıcaklık
95 °C | Zaman
5 sn |
| Tavlama | 53 °C | 10 saniye |
| uzantı | 72 °C | 20 Saniye |
| 5 °C | |
