Bir Murin Modelinde Otoimmün Artrit için Hücre Bazlı Bir Tedavi

Özet

Kaynak: Haque, M. et al., Otoimmüniteye Karşı Kök Hücre Kaynaklı Antijene Özgü Düzenleyici T Hücrelerinin Geliştirilmesi.J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, farelerde otoimmün artrit için hücre bazlı bir tedaviyi göstermektedir. Ovalbümin spesifik reseptörlerini eksprese eden iPSC'den türetilmiş T düzenleyici hücrelere, bir adjuvan içinde emülsifiye edilmiş metillenmiş sığır serum albümini (mBSA) enjekte edilir. Murin antijen sunan hücreler (APC'ler) mBSA'yı işler ve T hücrelerine sunar, bu da T hücresi aktivasyonunu ve diz ekleminin sinovyal zarına göçü tetikler. Sonraki enjeksiyonlar sol dizde tek başına mBSA'yı ve sağ dizde mBSA ve ovalbümin kombinasyonunu içerir. Sol dizde, mBSA'ya karşı bağışıklık tepkisi artriti tetiklerken, sağ dizde ovalbümin ile etkileşime giren T düzenleyici hücreler iltihabı hafifleterek artrit semptomlarını iyileştirir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Otoimmün Artritin İn Vivo Olgunlaşması ve Baskılanması

1. MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3 yapısını oluşturmak için OT-II T hücre reseptörü (TCR) genlerini ve çatal başlı kutu proteini 3'ü (FoxP3) kendi kendine bölünen peptit 2A ile bağlantılı MiDR plazmidine alt klonlayarak retroviral transdüksiyonda kullanılacak yapıları oluşturun.
2. Paketleme hücre hattı olarak Plat E hücrelerini kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) retroviral transdüksiyonunu gerçekleştirin.
3. Farelerde in vivo farklılaşma ve artrit indüksiyonu.
   1. OP9-DL1-DL4-I-A^b stromal hücreleri üzerinde OT-II TCR / FoxP3 ile iletilen iPSC'leri (OT-II-FoxP3 / iPSC'ler), FoxP3 ile dönüştürülmüş iPSC'leri ve DsRed ile dönüştürülmüş iPSC'leri sitokinler mFlt-3L ve mIL-7 varlığında 8 gün boyunca ayırt edin.
   2. 0. günde, OP-9 ortamı (% 20 fetal buzağı serumu (FCS) ve 2.2 g / L sodyum bikarbonat içeren α-MEM ortamı kullanarak OP9-DL1-DL4-I-A^b hücrelerini minimum 10⁴ hücre /^cm2 yoğunlukta tohumlayın. Tabak 1 x 10 10 cm'lik tabak başına⁶ hücre.
   3. 3. günde, OP9-DL1-DL4-I-A^b hücreleri %80-90 birleştiğinde, ortamı çıkarın ve OP-9 ortamındaki OP9-DL1-DL4--I-A^b hücreleri üzerinden 0,5 - 1 x 10⁵ iPSC tohumlayın.
      NOT: Bu, OP9-DL1-DL4-I-A^b hücreleri üzerinde iPSC'lerin ko-kültürünü oluşturur ve farklılaşmanın 0. günü olarak kabul edilir.
   4. 5. günde, ortamı 10 cm'lik tabaktan aspirasyon ile çıkarın, hücreleri 10 ml 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve PBS'yi aspire edin. 4 ml %0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin. Hücrelere 8 ml daha iPSC ortamı ekleyin, yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
      1. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 10 ml iPSC ortamında yeniden süspanse edin. Bu yeniden süspanse edilmiş hücreleri 10 cm'lik taze bir tabakta inkübe edin ve 30 dakika boyunca inkübatöre geri
         NOT: OP9-DL1-DL4-I-A^b besleyici hücrelerini çıkarın ve farklılaşan iPSC'leri ortamda tutun. Daha fazla ko-kültür için% 80 - 90 birleşme elde etmek için OP9-DL1-DL4-I-A^b hücrelerini sürekli olarak koruyun.
      2. 30 dakika sonra, yüzen hücreleri toplayın, 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün ve bir hemositometre ile sayın.
   5. OP9 ortamındaki OP9-DL1-DL4-I-A^b hücrelerinin %80 - 90 oranında taze bir birleşimine 5 x 10⁵ iPSC tohumlayın. Ortamı son 5 ng / ml konsantrasyonda mFlt-3L ile destekleyin.
   6. 10 cm'lik plakadan üç tür hücreyi de tripsinize edin ve her 10 cm'lik plakadan hücreleri 10 ml taze ortamda yeniden süspanse edin. Hücreleri 10 cm'lik yeni bir tabağa ekleyin ve 30 dakika boyunca inkübatöre geri dönün. 30 dakika sonra yüzen hücreleri toplayın.
   7. Hücre kümelerini çıkarmak ve bir hemositometre kullanarak saymak için hücreleri 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Hücreleri soğuk PBS'de 1.5 x 10⁷ hücre / ml konsantrasyona ayarlayın ve gerekirse tekrar süzün. Farelere evlat edinen hücre transferi olana kadar hücreleri buz üzerinde tutun.
   8. 200 μl hücre süspansiyonunu (3 x 10⁶ hücreli) kuyruk damarı yoluyla 4 - 6 haftalık dişi C57BL / 6 farelerden oluşan üç farklı gruba enjekte edin.
   9. 10. günde, hücre transferinden sonra, farelere 1 ml'lik bir şırınga kullanarak kuyruğun tabanında Freund'un tam adjuvanında emülsifiye edilmiş 100 μg metillenmiş sığır serum albümini (mBSA) enjekte edin.
   10. 17. günde, bir izofluran buharlaştırıcı kullanarak fareleri uyuşturun. İndüksiyon için% 4 - 5 ve bakım için% 1 - 2 izofluran kullanın. Sol diz ekleminde 10 μl PBS'de 20 μg mBSA ve sağ diz ekleminde 10 μl PBS'de 20 μg mBSA ve 100 μg tam ovalbümin (OVA) eklem içi enjeksiyonu ile artriti indükleyin. Artrit geliştikten sonra yatak zeminine yiyecek ve jel paketi yerleştirilebilir. Farelere ötenazi uygulanacak: Vücut Kondisyon Skoru (BCS) 2/5 veya can çekişen, şiddetli kaşeksi ve / veya kalıcı yaslanma (24 saatlik bir süre) ve şiddet skoru 4. Skor 4'te eritem ve şiddetli şişlik ayak bileğini kapsar, ayak ve parmaklar veya uzuvun ankilozları.
4. OT-II TCR/FoxP3 ile transdüksiyonlu iPSC'lerin karakterizasyonu.
   1. Sabitlenmemiş canlı DsRed⁺ GFP⁺ hücrelerini görselleştirmek için bir floresan mikroskobu (20X) kullanın.
   2. Hem Western blot hem de akış sitometrisi ile gen entegrasyonunu ve ekspresyonunu inceleyin.
5. Artrit baskılama testi
   1. Artrit indüksiyonundan önce farelerin her iki dizinin şişmesini, bir taban çizgisi oluşturmak için bir kadranlı pergel kullanarak ölçün.
   2. Artrit indüksiyonu ve Treg transferi için adımları (1.3.1 - 1.3.10) izleyin. Treg aktarımı sonrası kadranlı bir pergel ile fare dizlerini ölçün.
   3. Diz çapındaki artış yüzdesini hesaplayın: Yüzde Artış = (1. gün diz çapı - 0. gün diz çapı) / 0. gün diz çapı.
6. Dizlerde eklem harabiyeti ve inflamatuar hücre infiltrasyonunun histoloji ile ölçülmesi (Şekil 1).
   1. Artrit indüksiyonundan sonraki 7. günde, fareleri karbondioksit (CO₂) inhalasyonu ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yapın. Elektrikli bir kesme makinesi ile dizlerdeki tüyleri alın ve dizleri cerrahi işlemle çıkarın.
   2. Künt uçlu makasla arka bacağında bir kesi yaparak bacaklardaki cildi çıkarın ve cildi uyluk boyunca ayak bileğine kadar kesin. Kası ortaya çıkarmak için cildi bacak ve ayağın üzerinden nazikçe soyun. Diz eklemine zarar vermeden kası bacaktan dikkatlice çıkarın.
      1. Arka bacağı pelvik/kalça ekleminin hemen üzerinden kesin ve keskin diseksiyon makası kullanarak kaval kemiğini kesin.
   3. Dizleri 48 saat boyunca% 4 formalin içinde sabitleyin. 2,5 M formik asit kullanarak dizleri kireçten arındırın; Ksilen içinde 3 dakika boyunca üç kez durulayın,% 100 etanolde iki kez durulayın,% 95 etanolde iki kez durulayın, deiyonize suda iki kez 2 dakika durulayın ve 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içinde kireçten arındırın. Kaynama sıcaklığının altında (90 °C) 20 dakika muamele edin.
   4. Her iki dizinizi de çıkarın,% 10 formalin ile sabitleyin ve Formical-4'te kalsifiye edin. Dokuları Parafin'e gömün, 4 μm'de kesit alın ve hematoksilen ve eozin (H & E) veya Safranin O boyaması ile boyayın ve mikroskop altında gözlemleyin.

Sonuçlar

Şekil 1: Ag'ye özgü iPSC-Treg'lerin evlat edinme transferi farelerde AIA'yı iyileştirir. Murin iPSC'leri, retroviral yapı MiDR, MiDR-FoxP3 veya MiDR-TCR-FoxP3 ile transdüksiyona tabi tutuldu ve OP9-DL1 / DL4 / IA^b hücreleri üzerinde birlikte kültürlendi. 7. günde, gen transdüksiyonlu hücreler (3 × 10⁶ / fare), hücre transferinden iki hafta sonra AIA ile indüklene...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
C57BL/6j fareler	Jackson Laboratuvarı	664
α-MEM	Canlandırıcı	A10490-01
FBS (FBS)	Klon	SH3007.01
Polibren	Sigma	107689
Genetik bozucu	Entegre bilim	204130
mFlt-3L	Peprotech Teknolojisi	250-31L
mIL-7	Peprotech Teknolojisi	217-17
mBSA (İngilizce)	Sigma	A7906
Ova albümin	Avantor Avcısı	0440-01
Cfa	Difco Bilişim	2017014
Tailveiner tutucu	Braintree bilimsel	RTV 150-STD
Paraformaldehit	Sigma	P6148-500G	Dikkat: Alerjenik, Kanserojen, Zehirli

Serisi Serisi Serisi Teknolojileri