Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Splenektomi ve T Hücre Hazırlığı
Gün 0:
- 10 ml T hücre ortamını (TCM) 50 ml'lik bir konik içine dökün ve dalak toplanması için buzun üzerine yerleştirin.
- CO2 boğulması ve ikincil dekapitasyon ile uygun sayıda hayvanı kurban edin: Hayvanları, Amerikan Veteriner Hekimler Birliği yönergelerine göre (aynı anda en fazla 5 hayvan kurban edilebilir) solunum sona erene kadar ve daha sonra iki dakika boyunca, kafes hacmi/dakika% 10-30 akış hızında CO2 alan bir kafese yerleştirin. Hayvanları CO2 odasından çıkarın ve kafalarını kesin.
not: 6-12 haftalık dişi C57BL / 6 farenin bir dalağı yaklaşık 4.5-5 x 107 splenosit verecektir. Burada yaklaşık 200 x 106 hücre için 4 dalak toplanacaktır.
- Fareyi sağ tarafı yukarı bakacak şekilde yatırın ve %70 etanol püskürtün. Forseps ile sol göğüs kafesinin altından ince bir deri kıvrımı tutun ve makasla hafif bir kesi yapın. Cildi geri soyun, peritonun ince bir katını forseps ile dikkatlice tutun ve küçük bir boşluk kesin.
- Dalak, düzleştirilmiş bir fasulyeye benzeyen küçük, uzun, koyu kırmızı bir organdır; dalağı forseps ile nazikçe tutun ve çevreleyen bağ dokusunu keserek eksize edin. Eksize edilen dalakları buz üzerinde 10 ml TCM içeren konik içine yerleştirin.
- Dalakları 70 μm'lik bir ağ hücre süzgecinin üzerine dökün ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için 5 ml'lik bir şırınganın iç kısmının kör ucuyla ezerek ayırın. Ağ süzgeci başına en fazla iki dalak ayrılmalıdır.
- Kalan splenositleri toplamak için ayrıştırma işleminden sonra süzgeci dikkatlice yıkamak için küçük bir hacimde TCM kullanın. Tüm ayrıştırılmış dalakları tek hücreli bir süspansiyonda toplayın. Bir yıkama için TCM ile son hacmi 50 ml'ye getirin ve 10 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
- 45 ml steril suya 5 ml 10x lizis tamponu ekleyerek 1x lizis tamponu çözeltisi hazırlayın. Kırmızı kan hücrelerini ortadan kaldırmak için, peleti 50 ml'lik bir konik içinde dalak başına 5 ml 1x lizis tamponu içinde yeniden süspanse edin, hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. 5 dalağı aşıyorsa, 250 ml'lik bir santrifüj tüpü kullanın. Konik veya santrifüj tüpünü 5 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
- Lizis reaksiyonunu su banyosundan çıkarın ve reaksiyonu nötralize etmek için lizis tamponu ile 1: 1 oranında TCM ekleyin. 300 x g'da 10 dakika döndürerek yıkayın.
- Süpernatan peleti TCM'de (2 ml / dalak, 4 dalak için toplam 8 ml) yukarı ve aşağı pipetleyerek aspire edin ve tamamen yeniden süspanse edin.
- 190 μl tripan mavisine (1:20 seyreltme) 10 μl hücre süspansiyonu ekleyerek hücreleri sayın. Toplam hücre sayısını elde etmek için dört ızgaralı kareden birinde elde edilen sayıyı 20 x 104 x toplam hacim (8 ml) ile çarpın (örneğin, 125 hücre x 20 x 104 x 8 ml = 200 x 106 splenosit).
- Hücreleri, 2 μg / ml conkanavalin A (ConA) ve 50 IU / ml rekombinant insan interlökin-2 (rhIL-2) ile desteklenmiş TCM'de 2 x 106 hücre / ml konsantrasyona seyreltin. Böylece, 200 x 106 splenosit için, 8 ml hücrelere, 200 μg ConA'ya ve 5.000 IU rhIL-2'ye 92 ml ortam ekleyin.
- Her bir oyukta 4 x 106 hücre olacak şekilde 24 oyuklu doku kültürü ile muamele edilmiş plakaların her bir oyuğuna 2 mL hücre ekleyin (ör., 100 ml hücre yaklaşık 4 plaka gerektirecektir).
- Gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
2. İletim
1. Gün:
- Toplanan dalak sayısını 2 ile çarparak transdüksiyon için gerekli olan doku kültürü ile muamele edilmemiş 24 oyuklu plakaların sayısını hesaplayın (4 dalak için 8 plaka gereklidir).
- Daha sonra, (toplam kuyucuk sayısı + 3) x 0.5 ml (8 plaka x 24 kuyucuk = 192 + 3 = 195) x 0.5 ml = 97.5 ml ile çarparak plakaları kaplamak için gereken rekombinant insan fibronektin fragmanı (RHFF) çözeltisinin gerekli hacmini hesaplayın.
- Toplam hacmi 25 μg (97.5 x 25 = 2437.5 μg) ile çarparak 25 μg / ml konsantrasyonda RHFF içeren 97.5 ml fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın. Bu miktarda RHFF'yi 97.5 ml PBS'ye ekleyin.
- Doku kültürü ile muamele edilmiş 24 oyuklu plakaları, oyuk başına 0.5 ml PBS / RHFF çözeltisi ekleyerek kaplayın.
- Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
2. Gün:
- PBS / RHFF çözeltisini doku kültürü ile muamele edilmiş 24 oyuklu plakalardan boşaltın.
- PBS'ye 1 ml / kuyu% 2 sığır serum albümini (BSA) ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Plakayı sıkıca yukarı kaldırarak BSA'yı çıkarın. 2 ml PBS ekleyerek yıkayınız.
- Her bir İnsan embriyonik böbreğinden 293T (HEK293T) -poli-D-lizin (PDL) kaplı plakadan 250 ml'lik bir santrifüj tüpüne ortam aktararak viral süpernatan toplayın ve 500 x g'da 10 dakika döndürün.
- Viral süpernatanı dikkatlice 250 ml'lik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve oluşmuş olabilecek hücre peletini rahatsız etmediğinizden emin olun.
- Viral süpernatanıma taze TCM ekleyin, böylece nihai hacim RHFF kaplı kuyucuklar için gereken miktardan 3 ml daha fazla olur. Örneğin, 192 RHFF kaplı kuyucuk için, viral süpernatan hacmini 192 + 3 ml = 195 ml'ye getirin.
- Kültürlenmiş splenositleri inkübatörden çıkarın ve her bir oyukta 2-3 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. 250 ml'lik bir koniğe aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanıyorsanız, aktarımdan önce steril bir rezervuar kullanmak bu adımı hızlandırmaya yardımcı olacaktır. Daha önce tarif edildiği gibi sayın ve 10 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
- Rekombinant insan interlökin-2 (rhIL-2) 50 IU / ml'lik bir konsantrasyonda viral süpernata ekleyin. Örneğin, 195 ml viral süpernatan için 50 x 195 = 9.750 IU rhIL-2 ekleyin.
- Viral süpernatanttaki splenositleri 1 x 106 hücre / ml'de yeniden süspanse
edin
- RHFF kaplı 24 oyuklu plakalara 1 ml / kuyu splenosit süspansiyonu ekleyin.
- Aşağıdaki ayarlara göre 90 dakika döndürün: 770 x g, hızlanma = 4, frenleme/yavaşlama = 0, 32 °C.
- 50 IU / ml rhIL-2 ile bir TCM çözeltisi hazırlayın. Örneğin, 10.000 IU rhIL-2 ekleyerek 200 TCM'lik bir çözelti hazırlayın. Santrifüjlemeden sonra her oyuğa 1 ml rhIL-2 / TCM ekleyin.
- % 5 CO2 içinde 37 ° C'de gece boyunca kültür.
>3. CAR T hücresi Kültürü ve Hasat
3. ve 4. günler:
- T hücreleri %>80 birleşme elde ederse, hücreler bölünebilir (bu genellikle 3. veya 4. günde gerçekleşir). Hücreleri bölmek için, her bir oyukta 2-3 kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin ve her oyuktan 1 ml'yi 24 oyuklu taze bir doku kültürü ile muamele edilmiş plakanın yeni oyuklarına taşıyın. Daha sonra, her bir oyuğa 50 IU / ml IL-2 içeren 1 ml taze TCM ekleyin, böylece tüm oyuklarda nihai hacim 2 ml olur.
- Hücreler %>80 birleşmeye ulaşmazsa, her bir oyuğun üstünden 1 ml ortamı yavaşça pipetleyerek yarım ortam değişikliği yapın. Ortamı çıkarırken tabana yerleşmiş hücreleri rahatsız etmekten kaçının. 50 IU / ml rhIL-2 içeren 1 ml taze TCM ekleyin.
5. Gün:
- Her bir oyukta 3 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek CAR T hücrelerini yeniden askıya alın ve 250 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 10 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
- Rahatsız edici peleti olmadan süpernatanı tamamen aspire edin. PBS ile bir kez yıkayın, daha önce tarif edildiği gibi hücreleri sayın ve PBS ile ikinci kez yıkayın. Tipik bir CAR T hücresi verimi, oyuk başına yaklaşık 1 x 106 hücredir (8 plaka x 24 kuyucuk = 192 x 106 CAR T hücresi).
- 200 μg'lık bir hacimde 1 x 107'lik bir enjeksiyon için 5 x 107 / ml konsantrasyonda PBS'deki hücreleri yeniden süspanse edin (ör., 192 x 106 CAR T hücreleri için, yıkanmış peleti 3.84 ml PBS'de yeniden süspanse edin).
