Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Sitotoksik Efektör T Lenfositlerinin Spesifik Olmayan Genişlemesi
- Besleyici hücreleri 35 Gy'de hazırlayın ve ışınlayın. 2 x 105 - 4 x 105 efektör hücrenin uyarılması için, üç farklı, sağlıklı donörden 10 x 106 periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) ve 1 x 106 B-lenfoblastoid hücre hatları (BLCL'ler) hazırlayın.
- % 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS), 2 mM L-glutamin, penisilin (100 IU / mL) ve streptomisin (0.1 μg / mL) ve 300 IU / mL rekombinant interlökin-2 (IL-2) ile desteklenmiş 15 mL Roswell Park Memorial Institute ortamında (RPMI) hem besleyici hücreleri hem de efektör hücreleri yeniden süspanse edin.
- 1 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyonda fitohemaglutinin (PHA-L) ekleyin, dikkatlice karıştırın ve 96 oyuklu U tabanlı plakalarda oyuk başına 150 μL hücre süspansiyonu dağıtın.
- Nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de ve% 5 CO2 ile inkübe edin.
- Kültür kuyucuklarında büyük hücre kümeleri oluşana kadar plakayı günlük olarak kontrol edin (~ gün 7).
- Hücreleri taze kültür ortamında 1 x 106 hücre / mL'lik bir kültür şişesine aktarın.
- Toplam hücre sayısını sayarak (haftada 2 kez) belirleyin ve bunları taze kültür ortamında 1 x 106 hücre / mL'de tutun.
not: Efektör bağışıklık hücreleri, dinlenme durumunda (genellikle ilk amplifikasyon uyaranından 3 hafta sonra) terapötik uygulama için hazır olmalıdır. Bu efektör hücrelerin saflığı ve reaktivitesi, in vivo enjeksiyonlardan önce kontrol edilmelidir (ör., in vitro deneylerle).
2. Ameliyat Öncesi Efektör Hücre Hazırlığı
- Efektör hücre sayısını kontrol ettikten sonra, efektör hücreleri santrifüjleme ile 50 mL'lik bir tüpte toplayın (5 dakika boyunca 300 x g).
not: Herhangi bir kaybı telafi etmek için fazla hücre hazırlayın (örneğin, 50 x 106).
- Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücreleri 15 mL steril PBS'de yeniden süspanse edin ve yıkamayı gerçekleştirmek için 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı dikkatlice ve tamamen çıkarın ve ardından hücre peletini 1 mL steril PBS'de yeniden süspanse edin.
- Yeniden süspanse edilmiş hücreleri, 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme için 1.5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.
- Yavaşça pipetleyerek süpernatanı dikkatlice ve tamamen çıkarın.
- Hücre peletini fare başına 8 μL steril PBS'de yeniden süspanse edin.
not: Bu kritik bir adımdır.
- Bir mikropipet kullanarak hücre süspansiyonunun hacmini ölçün. Gerekirse, steril PBS (doz başına 15 μL PBS'de 20 x10 6 hücre) ekleyin ve dikkatlice karıştırın.
- Bir mikropipet kullanarak, fare başına son hacmin 15 ila 20 μL (zorunlu olarak 20 μL<) arasında olduğunu kontrol edin.
- Stereotaktik enjeksiyona kadar hücreleri buz üzerinde tutun.
not: 3 saatten fazla zaman noktası test edilmedi.
3. Stereotaktik Enjeksiyon
- Ekipman kurulumu
- İntrakraniyal enjeksiyonların doğruluğunu sağlamak için (örn. şırınga boyutu, istenen hacim ve enjeksiyon hızı) üreticinin talimatlarına göre küçük bir hayvan stereotaktik çerçevesini monte edin ve kalibre edin.
not: Yavaş bir infüzyon hızı önerilir (ör., 2-3 μL / dak).
- Aletlerin sterilitesini korumak ve fareleri enfeksiyonlardan korumak için malzemeyi bir mikrobiyal güvenlik kabininin (MSC) altına yerleştirin.
not: "İzotermal blokları" 37 °C'de bir su banyosuna yerleştirin. Bu sistem, ameliyat sırasında farelerin hipotermisini sınırlar. İşlem sonrası bakım için gerekli olan ısıtma yastıkları, sürekli sıcaklık izleme sırasında kullanılmalıdır.
- Ameliyat öncesi hayvan hazırlığı
- Farenin vücut ağırlığının 10 μL/g'sinde intraperitoneal ketamin (10 mg / mL) ve ksilazin (0.1 mg / mL) enjeksiyonu ile bir fareyi uyuşturun.
- Hayvanın tam anestezi ve analjezisini sağlamak için bir ayak parmağı sıkışma testi yapın.
not: Herhangi bir hareket derin olmayan analjezinin bir göstergesidir ve bu meydana gelirse, işlemi tekrarlamadan önce birkaç dakika daha gereklidir.
- Fare uygun şekilde uyuşturulduktan sonra, kürkü ameliyat bölgesinden (iki kulak arasında, buruna kadar) çıkarmak için makas kullanın.
- Ameliyat öncesi hücre hazırlığı
- Herhangi bir hücre topaklanmasını önlemek için her enjeksiyondan önce hücreleri bir pipetle (birkaç kez) dikkatlice yeniden süspanse edin.
- Kabarcıkların aspirasyonunu önlemek için gerekli hücre süspansiyon hacmini (15 - 20 μL) 22 G mikroşırıngaya dikkatlice çekin.
not: Mikroşırıngaya bu hücre yükleme adımı, enjekte edilen hacimlerdeki varyansları en aza indirmek için önemlidir. Herhangi bir hücre topaklanmasını önlemek ve kohortta eşit sayıda efektör hücre uygulanmasını sağlamak için prosedürler arasında her bir enjeksiyon için hücreleri yeniden yükleyin.
- Ardından, şırıngayı uyarlanan şırınga pompasına yerleştirin.
- Prosedürel bakım
- Cerrahi bölgeyi en az 3 kez povidon-iyot% 5 çözeltisine batırılmış çubuklarla dezenfekte edin.
- Korneaların kurumasını önlemek için farenin gözlerine kayganlaştırıcı bir oftalmik merhem yerleştirin.
- Anestezi uygulanmış fareyi, ameliyat sırasında farenin sıcaklığını korumak ve mortaliteyi sınırlamak için steril bir plastik sargı ile kaplı sıcak bir izotermal blok üzerine stereotaktik çerçeve üzerine yerleştirin.
not: İşlem sırasında yeterli solunum akışını sağlamak için farenin burnu ve dişleri diş çubuğunun üzerine uygun şekilde yerleştirilmelidir.
- Fare diş çubuğunun üzerine yerleştirildikten sonra, başı hareketsiz hale getirmek için kulak çubuklarını farenin kulaklarının altına sıkıca sıkın.
not: Kulak zarlarına zarar vermemeye veya solunumu tehlikeye atmamaya dikkat edin.
- Kafatasını ortaya çıkarmak için kafatasının üst kısmı boyunca önden arkaya steril makasla 1-2 cm orta hat sagital cilt kesisi yapın.
- Enjeksiyondan önce stereotaktik lokalizasyon için yer işareti olarak hizmet etmek üzere sagital ve koronal sütürlerin (Bregma) kesişimini tanımlayın (Şekil 1'de gösterilmiştir).
- Mikroşırıngayı bu noktanın üzerine yerleştirin.
- Mikroşırıngayı Bregma'nın 2 mm sağ lateral ve 0,5 mm ön kısmına hareket ettirin.
- Bir mikro matkap kullanarak, önceden belirlenmiş koordinatlarda steril bir matkap ucuyla kafatasında küçük bir delik açın. Beynin herhangi bir travmatik yaralanmasını önlemek için yüzeysel kalmaya dikkat edin.
not: Bu protokolde, bağışıklık hücreleri yerleşik bir tümör içine enjekte edildi (tümör hücresi enjeksiyonundan bir hafta sonra). Cilt yeniden açılmalıdır (yara izi) ve enjeksiyon, tümör hücresi implantasyonu için kullanılan aynı koordinatlarda gerçekleştirilir (delik genellikle enjeksiyondan 2 hafta sonrasına kadar hala mevcuttur). Beyin parankimine tümör ve efektör hücrelerin enjekte edilmesi için koordinatlar seçildi.
- İmmün efektör hücrelerin enjeksiyonu
- Mikroşırıngayı dikkatlice delinmiş deliğe yerleştirin ve yavaşça hareket ederek, efektör hücreleri enjekte etmeden önce iğneyi durada 3 mm aşağı ve ardından 0,5 mm geriye doğru 2,5 mm'lik son derinliğe kadar ilerletin.
- Efektör hücre enjeksiyonunu 2 - 3 μL / dk'da çalıştırın ve fareleri enjeksiyon süresi boyunca izleyin.
- Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, iğneyi sadece 1 mm çekin ve infüzyon bölgesinden herhangi bir sızıntıyı önlemek için mikroşırıngayı yavaşça tamamen çekmeden önce mikroşırıngayı bir dakika daha yerinde tutun.
not: Hayvanın stereotaktik cihazdan çıkarılmasının ardından, yaklaşan deneyler için enjeksiyon ekipmanını hemen temizleyin.
- Mouse'un ameliyat sonrası bakımı ve takibi
- Hayvanı stereotaktik çerçeveden çıkarın ve hemen insizyon bölgesine povidon-iyot% 5 solüsyonu uygulayın ve cildi uygun bir cerrahi dikişle kapatın.
- % 2 lidokain jeli doğrudan yaranın üzerine uygulayın ve işlem sonrası analjezi için deri altı enjeksiyonla 0.15 μg / g buprenorfin uygulayın.
- Uygun bir fare vücut sıcaklığını korumak ve herhangi bir hipotermiyi önlemek için anestezi uygulanmış fareyi 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığının üzerindeki kafesine geri yerleştirin.
not: Ayrı bir muhafaza gerekli değildir.
- Fareyi anesteziden tamamen kurtulana kadar izleyin ve bir muhafaza odasına aktarın.
not: Bugüne kadar, bu protokol birkaç öngörülemeyen komplikasyon meydana geldiğinden (enjekte edilen farelerin <% 5'i) iyi bir şekilde desteklenmektedir.
- Fareleri günlük olarak izleyin ve herhangi bir sağlık belirtisi azaldığında (örneğin, kambur duruş, azalmış hareketlilik, secde veya önemli vücut ağırlığı kaybı [≥% 15]) onlara ötenazi yapın.
