Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

CRISPR-Cas9 Sistemi Kullanarak CAR T Hücrelerini Genetik Olarak Değiştirme

1.9K görüntülenme

⸱

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

Kaynak: Sterner, RM ve diğerleri, CAR-T Hücrelerinde GM-CSF'yi Devre Dışı Bırakmak için CRISPR/Cas9 Kullanma.J. Vis. Uzm. (2019)

Video, CRISPR-Cas9 Sistemi aracılığıyla genetik olarak değiştirilmiş CAR T hücreleri oluşturma sürecini özetlemektedir. T hücrelerinin CRISPR ve CAR lentivirüsleri ile enfekte edilmesi, hedef gende modifikasyonlara ve bir kimerik antijen reseptörü veya CAR'ın sentezine neden olur ve sonuçta genetik olarak değiştirilmiş CAR T hücrelerinin oluşumuna yol açar.

Protokol

1. CART19 hücre üretimi

  1. T hücresi izolasyonu, stimülasyon ve ex-vivo kültür
    1. Tüm hücre kültürü çalışmalarını, uygun kişisel koruyucu ekipman kullanarak bir hücre kültürü başlığında gerçekleştirin. Aferez sırasında toplanan tanımlanmamış normal donör kan konilerinden periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) toplayın, çünkü bunların uygun bir PBMC kaynağı olduğu bilinmektedir.
    2. PBMC'leri izole etmek için, 50 mL'lik bir yoğunluk gradyan ayırma tüpüne 15 mL'lik bir yoğunluk gradyan ortamı ekleyin. Hücre sıkışmasını önlemek için donör kanını% 2 fetal sığır serumu (FBS) içeren eşit hacimde fosfat tamponlu salin (PBS)....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CD3 Monoklonal Antikor (OKT3), PE, eBioscienceCanlandırıcı12-0037-42
CD3 Monoklonal Antikor (UCHT1), APC, eBioscienceCanlandırıcı17-0038-42
Seçim Taq Mavisi MastermixDenville BilimselC775Y51
CTS (Hücre Tedavi Sistemleri) Dynabeads CD3/CD28Gibco (Gibco)40203D
CytoFLEX Sistemi B4-R2-V2Beckman Coulter'ın fotoğrafı.C10343Akış sitometresi
Dimetil sülfoksitKırlangıç SigmaD2650-100ML
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu SuyuGibco (Gibco)14190-144
Dynabeads MPC-S (Manyetik Parçacık Konsantratörlü)Uygulamalı BiyosistemlerA13346
Kolay 50 EasySep MıknatısKÖK HÜCRE Teknolojileri18002
EasySep İnsan T Hücresi İzolasyon Kiti KÖK HÜCRE Teknolojileri17951Negatif seçim manyetik boncuklar; 17951RF, uçlar ve tampon içerir
Fetal sığır serumuKırlangıç SigmaF8067
FITC Fare Anti-İnsan CD107a BD Pharmingen555800
Fiksasyon Ortamı (Orta A)CanlandırıcıGAS001S100
GenCRISPR gRNA Yapısı: İsim: CSF2GenScript YokÖzel sipariş
CRISPR kılavuzu RNA 1; Tür: İnsan, Vektör:
pLentiCRISPR v2; Direnç: ampisilin; Kopya numarası:
yüksek; Plazmid hazırlığı: Standart teslimat: 4 μg (Ücretsiz
ücretli)
Keçi anti-fare IgG (H + L) çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikor, Alexa Fluor 647CanlandırıcıA-21235
https://tide.nki.nl.Masaüstü Genetiği
İnsan AB Serumu; Erkek Bağışçılar; AB tipi; ABDCorning35-060-CI
IFN gama Monoklonal Antikoru (4S. B3), APC-eFluor 780, eBiyobilimCanlandırıcı47-7319-42
Lipofektamin 3000 Transfeksiyon ReaktifiCanlandırıcıL3000075
CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre Leke Kiti, 405 nm uyarma içinCanlandırıcıL34966
LenforepKÖK HÜCRE Teknolojileri7851
Monensin Çözümü, 1000XBiyo Efsane420701
Fare Anti-İnsan CD28 Klon CD28.2BD Pharmingen559770
Fare Anti-İnsan CD49d Klonu 9F10BD Pharmingen561892
Fare Anti-İnsan MIP-1β PE-CY7BD Pharmingen560687
Bay Frosty Dondurma KabıTermo Bilimsel5100-0001
NALM6, klon G5 ATCC (Uzay Servisi)CRL-3273Akut lenfoblastik lösemi hücre hattı
Nükleaz İçermeyen SuPromegaP119C
Olympus Vakum Filtre Sistemleri, 500 mL, PES Membran, 0.22uM, sterilGenesee Bilimsel25-227
Olympus Vakum Filtre Sistemleri, 500 mL, PES Membran, 0.45uM, sterilGenesee Bilimsel25-228
Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı (1X), SıvıGibco (Gibco)31985-070
PE-CF594 Fare Anti-İnsan IL-2BD Ufuk562384
Penisilin-Streptomisin-Glutamin (100X), SıvıGibco (Gibco)10378-016
Geçirgenlik Ortamı (Orta B)CanlandırıcıGAS002S100
PureLink Genomik DNA Mini KitiCanlandırıcıK182001
Puromisin DihidroklorürMP Biyomedikal A.Ş.210055210
QIAquick Jel Ekstraksiyon KitiQIAGEN (Türkçe)28704
Sıçan Anti-İnsan GM-CSF BV421BD Ufuk562930
RoboSep-S (RoboSep-S)KÖK HÜCRE Teknolojileri21000Tam Otomatik Hücre Ayırıcı
Eylül Mate-50 (IVD)KÖK HÜCRE Teknolojileri85450
Sodyum Azide, %5 (a/h)Ricca Kimya7144.8-16
X-VIVO 15 Serumsuz Hematopoetik Hücre OrtamıFransa04-418Ç
Serisi Serisi Serisi Adet Serisi Serisi Serisi Sayılı Kanun Hükmünde Kararname Serisi Fuar Sınıfı adet Haber Bülteni

Daha fazla makale keşfet

Lentivirüs TransdüksiyonuGen NakavtıPuromisin SeçimiT Hücresi ModifikasyonuKimerik Antijen ReseptörüGranülosit-Makrofaj Koloni Uyarıcı FaktörUltrasantrifügasyonAntibiyotik Direnci