CRISPR-Cas9 Sistemi Kullanarak CAR T Hücrelerini Genetik Olarak Değiştirme

Özet

Kaynak: Sterner, RM ve diğerleri, CAR-T Hücrelerinde GM-CSF'yi Devre Dışı Bırakmak için CRISPR/Cas9 Kullanma.J. Vis. Uzm. (2019)

Video, CRISPR-Cas9 Sistemi aracılığıyla genetik olarak değiştirilmiş CAR T hücreleri oluşturma sürecini özetlemektedir. T hücrelerinin CRISPR ve CAR lentivirüsleri ile enfekte edilmesi, hedef gende modifikasyonlara ve bir kimerik antijen reseptörü veya CAR'ın sentezine neden olur ve sonuçta genetik olarak değiştirilmiş CAR T hücrelerinin oluşumuna yol açar.

Protokol

1. CART19 hücre üretimi

1. T hücresi izolasyonu, stimülasyon ve ex-vivo kültür
   1. Tüm hücre kültürü çalışmalarını, uygun kişisel koruyucu ekipman kullanarak bir hücre kültürü başlığında gerçekleştirin. Aferez sırasında toplanan tanımlanmamış normal donör kan konilerinden periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) toplayın, çünkü bunların uygun bir PBMC kaynağı olduğu bilinmektedir.
   2. PBMC'leri izole etmek için, 50 mL'lik bir yoğunluk gradyan ayırma tüpüne 15 mL'lik bir yoğunluk gradyan ortamı ekleyin. Hücre sıkışmasını önlemek için donör kanını% 2 fetal sığır serumu (FBS) içeren eşit hacimde fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin.
      1. Seyreltilmiş donör kanını koniden ayırma tüpüne ekleyin, kan ile yoğunluk gradyan ortamı arasındaki arayüzü bozmamaya dikkat edin. RT'de 10 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüjleyin.
      2. Süpernatanı yeni bir 50 mL konik içine boşaltın, 40 mL'ye kadar getirerek PBS +% 2 FBS ile yıkayın, RT'de 8 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin, 40 mL tamponda yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın.
   3. Üreticinin protokolüne göre tam otomatik bir hücre ayırıcı kullanarak negatif seçimli bir manyetik boncuk kiti aracılığıyla T hücrelerini PBMC'lerden izole edin.
   4. İzole edilmiş T hücrelerini kültürlemek için, %10 insan AB serumu (h/v), %1 penisilin-streptomisin-glutamin (h/v) ve serumsuz hematopoietik hücre ortamından oluşan T hücresi ortamını (TCM) hazırlayın. Ortamı 0,45 μm steril vakum filtresinden ve ardından 0,22 μm steril vakum filtresinden süzerek sterilize edin.
   5. 0. günde (T hücresi stimülasyonunun olduğu gün), T hücrelerinin stimülasyonundan önce CD3 / CD28 boncuklarını yıkayın. Yıkamak için gerekli hacimde boncuk yerleştirin (3: 1 boncuk oranı için yeterli CD3 / CD28 boncuk kullanın: T hücreleri; boncukların konsantrasyonunun değişken olabileceğini unutmayın) steril bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde ve 1 mL TCM'de yeniden süspansiyon halinde.
   6. Bir mıknatıs ile temas edecek şekilde yerleştirin.
   7. 1 dakika sonra, TCM'yi aspire edin ve boncukları yıkamak için 1 mL taze TCM'de tekrar süspanse edin.
   8. Bu işlemi toplam üç yıkama için tekrarlayın.
   9. Üçüncü yıkamadan sonra, boncukları 1 mL TCM içinde tekrar süspanse edin.
   10. T hücrelerini sayın.
   11. Boncukları T hücrelerine 3:1 boncuk oranında aktarın: hücreler.
   12. Hücreleri 1 x 10⁶ hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.
   13. 37 ° C'de,% 5 CO₂ 24 saat inkübe edin.
2. T hücre transfeksiyonu ve transdüksiyonu
   1. Hücre kültürü davlumbazları, kişisel koruyucu ekipman ve kullanılmış malzemelerin atılmadan önce çamaşır suyu ile dezenfekte edilmesi dahil olmak üzere BSL-2+ önlemlerini kullanarak lentiviral çalışma yapın.
   2. Bir lentiviral vektörde bir kimerik antijen reseptörü-T19 (CART19) yapısı edinin.
      not: Burada kullanılan CART19 yapısı, ticari olarak temin edilebilen bir protein sentezi satıcısı kullanılarak de novo olarak tasarlanmış ve daha sonra sentezlenmiştir. CAR yapısı daha sonra bir EF-1α promotörü kontrolü altında üçüncü nesil bir lentivirüse klonlandı. Tek zincirli değişken bölge parçası, FMC63 klonundan türetilmiştir ve insan CD19'unu tanır. CAR19 yapısı, ikinci nesil bir 4-1BB kostimülatör alana ve CD3ζ stimülasyonuna (FMC63-41BBz) sahiptir.
   3. Daha önce tarif edildiği gibi lentiviral üretim gerçekleştirin.
      1. Kısacası, lentivirüs üretmek için% 70-90 birleşmeye ulaşmış 293T hücrelerini kullanın.
      2. 15 μg ilgilenilen lentiviral plazmid, 18 μg gag/pol/tat/rev paketleme vektörü, 7 μg VSV-G zarf vektörü, 111 μL ön kompleks oluşturucu reaktif, 129 μL transfeksiyon reaktifi ve 9.0 mL transfeksiyon ortamı dahil olmak üzere transfeksiyon reaktiflerinin oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilmesine izin verin. Daha sonra transfekte edilmiş hücreleri 37 °C,% 5 CO_2'de kültürleyin.
      3. Hasat, santrifüj (10 dakika boyunca 900 x g), filtre (0.45 μM naylon filtre) ve süpernatanı 18 saat boyunca 13.028 x g'de veya 2 saat boyunca 112.700 x g'de ultrasantrifüjleme ile 24 ve 48 saatte konsantre edin.
      4. İleride kullanmak üzere -80 °C'de dondurun.
   4. 1. Günde, 0. günde 1 x 10⁶ / mL'de uyarılan T hücrelerinin rozetlerini parçalamak için T hücrelerini nazikçe yeniden askıya alın.
   5. Tüm lentiviral çalışmalar için uygun BSL-2 + önlemleri altında, uyarılmış T hücrelerine 3.0'lık bir enfeksiyon çokluğunda (MOI) taze veya dondurulmuş hasat edilmiş virüs ekleyin.
3. CAR T hücresi genişletme
   1. Genleşme aşaması sırasında, transdüksiyona uğrayan T hücrelerini 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe etmeye devam edin. 3. ve 5. günlerde CAR T hücrelerini sayın ve 1 x 10⁶ / mL'lik bir CAR T hücresi konsantrasyonunu korumak için kültüre taze, önceden ısıtılmış TCM ekleyin.
   2. Bir mıknatıs kullanarak stimülasyondan 6 gün sonra (6. gün) transdüksiyon yapılan T hücrelerinden boncukları çıkarın. T hücrelerini hasat edin, yeniden süspanse edin ve 50 mL'lik konik tüplere 1 dakika boyunca bir mıknatıs içine yerleştirin. Ardından süpernatanı toplayın (CAR T hücrelerini içerir) ve boncukları atın.
   3. Toplanan CAR T hücrelerini, genişlemeye devam etmek için 1 x 10⁶ hücre / mL konsantrasyonda kültüre geri yerleştirin.
   4. 6. Günde, akış sitometrisi ile CAR'ın yüzey ekspresyonunu değerlendirin.
      not: CAR'ın yüzey ekspresyonunu tespit etmek için, bir keçi anti-fare IgG (H + L) çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikor ile boyama veya bir florokrom ile konjuge edilmiş bir CD19 spesifik peptit ile boyama gibi çeşitli yöntemler kullanılabilir. Burada, kültürden bir alikot (yaklaşık 100.000 T hücresi) alın ve Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini,% 2 fetal sığır serumu ve% 1 sodyum azid ile hazırlanan akış tamponu ile yıkayın. Hücreleri anti-CAR antikoru ile boyayın ve iki kez yıkayın. Hücreleri canlı/ölü leke ve CD3 monoklonal antikoru (OKT3) ile boyayın. Hücreleri yıkayın ve akış tamponunda yeniden süspanse edin. Transdüksiyon verimliliğini belirlemek için bir sitometre üzerinde edinin.
4. CAR T hücreli kriyoprezervasyon
   1. Stimülasyondan 8 gün sonra (T hücresi genişlemesinin 8. günü) CAR T hücrelerini hasat etmek ve kriyoprezervasyon yapmak için, hücreleri kültürden hasat edin.
   2. 300 x g'da 5 dakika aşağı döndürün.
   3. % 10 dimetil sülfoksit ve% 90 fetal sığır serumundan oluşan dondurma ortamında flakon başına mL başına 10 milyon hücrede donma ortamında yeniden süspansiyon edin.
   4. -80 °C'lik bir dondurucuda -1 °C/dk'lık bir soğutma hızı elde etmek için bir dondurma kabında dondurun ve 48 saat sonra sıvı nitrojene aktarın.
   5. İn vitro veya in vivo deneyler için kullanılmadan önce, CAR T hücrelerini ılık TCM'de çözün.
   6. Dimetil sülfoksiti seyreltmek ve çıkarmak için hücreleri yıkayın ve ılık TCM'de 2 x 10⁶ hücre / mL konsantrasyona yeniden süspanse edin. Gece boyunca 37 °C, %5 CO_2'de dinlendirin.

>2. Granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF ^k/o) CART19 üretimi

1. GM-CSF'yi bozmak için, daha önce insan sitokini kodlayan CSF2 geni için yüksek verimliliğe sahip olduğu bildirilen gRNA'ların taranması yoluyla seçilen insan GM-CSF'nin (CSF2) ekzon 3'ünü hedefleyen bir kılavuz RNA (gRNA) kullanın.
   not: Bu gRNA'yı (bir U6 promotörü altında) içeren ticari olarak sentezlenmiş bir araştırma sınıfı Cas9 üçüncü nesil lentiviral yapı kullanıldı. Yapı, bir puromisin direnç geni içerir. gRNA'nın dizisi GACCTGCCTACACACCCCC'dir.
2. Lentivirüs üretmek için,% 70-90 birleşmeye ulaşan 293T hücrelerini kullanın.
3. 15 μg ilgilenilen lentiviral plazmide, 18 μg gag/pol/tat/rev paketleme vektörüne, 7 μg VSV-G zarf vektörüne, 111 μL ön kompleks oluşturucu reaktife, 129 μL transfeksiyon reaktifine ve 9.0 mL transfeksiyon ortamının oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilmesine izin verin.
4. 293T hücrelerine transfeksiyon reaktifleri ekleyin. 37 °C'de kültür,% 5 karbondioksit (CO_{2 ).}
5. Hasat, santrifüj (10 dakika boyunca 900 x g), filtre (0.45 μM naylon filtre) ve süpernatanı 18 saat boyunca 13.028 x g'da veya 2 saat boyunca 112.700 x g'de ultrasantrifüjleme ile 24 ve 48 saatte konsantre edin ve ileride kullanmak üzere -80 ° C'de dondurun.
6. 1. Günde, rozetleri parçalamak için T hücrelerini nazikçe yeniden askıya alın.
7. BSL-2+ onaylı bir laboratuvarda, CAR T hücreleri oluşturmak için uyarılmış T hücrelerine donmuş veya taze hasat edilmiş bir virüs ekleyin. Hem CAR19 lentivirüsü hem de CRISPR lentivirüsünü hedefleyen GM-CSF ile T hücrelerini dönüştürün. 3'lük bir MOI'de CAR19 lentivirus ekleyin. CRISPR lentivirüsünün titrasyonu mümkün olmadığından, 10 x 10⁶ T hücrelerini dönüştürmek için 15 ug plazmit preparatından üretilen virüs parçacıklarını kullanın.
8. Adım 1'de tartışıldığı gibi T hücresi stimülasyonu, genişlemesi ve kriyoprezervasyonunun kalan adımlarına bakın.
9. Puromisin direnci taşıyan lentiCRISPR ile düzenlenmiş T hücreleri için, hücreleri 3. ve 5. günde 1 mL başına 1 μg puromisin konsantrasyonunda puromisin dihidroklorür ile tedavi edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CD3 Monoklonal Antikor (OKT3), PE, eBioscience	Canlandırıcı	12-0037-42
CD3 Monoklonal Antikor (UCHT1), APC, eBioscience	Canlandırıcı	17-0038-42
Seçim Taq Mavisi Mastermix	Denville Bilimsel	C775Y51
CTS (Hücre Tedavi Sistemleri) Dynabeads CD3/CD28	Gibco (Gibco)	40203D
CytoFLEX Sistemi B4-R2-V2	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	C10343	Akış sitometresi
Dimetil sülfoksit	Kırlangıç Sigma	D2650-100ML
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu	Gibco (Gibco)	14190-144
Dynabeads MPC-S (Manyetik Parçacık Konsantratörlü)	Uygulamalı Biyosistemler	A13346
Kolay 50 EasySep Mıknatıs	KÖK HÜCRE Teknolojileri	18002
EasySep İnsan T Hücresi İzolasyon Kiti	KÖK HÜCRE Teknolojileri	17951	Negatif seçim manyetik boncuklar; 17951RF, uçlar ve tampon içerir
Fetal sığır serumu	Kırlangıç Sigma	F8067
FITC Fare Anti-İnsan CD107a	BD Pharmingen	555800
Fiksasyon Ortamı (Orta A)	Canlandırıcı	GAS001S100
GenCRISPR gRNA Yapısı: İsim: CSF2	GenScript	Yok	Özel sipariş
CRISPR kılavuzu RNA 1; Tür: İnsan, Vektör:
pLentiCRISPR v2; Direnç: ampisilin; Kopya numarası:
yüksek; Plazmid hazırlığı: Standart teslimat: 4 μg (Ücretsiz
ücretli)
Keçi anti-fare IgG (H + L) çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikor, Alexa Fluor 647	Canlandırıcı	A-21235
https://tide.nki.nl.	Masaüstü Genetiği
İnsan AB Serumu; Erkek Bağışçılar; AB tipi; ABD	Corning	35-060-CI
IFN gama Monoklonal Antikoru (4S. B3), APC-eFluor 780, eBiyobilim	Canlandırıcı	47-7319-42
Lipofektamin 3000 Transfeksiyon Reaktifi	Canlandırıcı	L3000075
CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre Leke Kiti, 405 nm uyarma için	Canlandırıcı	L34966
Lenforep	KÖK HÜCRE Teknolojileri	7851
Monensin Çözümü, 1000X	Biyo Efsane	420701
Fare Anti-İnsan CD28 Klon CD28.2	BD Pharmingen	559770
Fare Anti-İnsan CD49d Klonu 9F10	BD Pharmingen	561892
Fare Anti-İnsan MIP-1β PE-CY7	BD Pharmingen	560687
Bay Frosty Dondurma Kabı	Termo Bilimsel	5100-0001
NALM6, klon G5	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-3273	Akut lenfoblastik lösemi hücre hattı
Nükleaz İçermeyen Su	Promega	P119C
Olympus Vakum Filtre Sistemleri, 500 mL, PES Membran, 0.22uM, steril	Genesee Bilimsel	25-227
Olympus Vakum Filtre Sistemleri, 500 mL, PES Membran, 0.45uM, steril	Genesee Bilimsel	25-228
Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı (1X), Sıvı	Gibco (Gibco)	31985-070
PE-CF594 Fare Anti-İnsan IL-2	BD Ufuk	562384
Penisilin-Streptomisin-Glutamin (100X), Sıvı	Gibco (Gibco)	10378-016
Geçirgenlik Ortamı (Orta B)	Canlandırıcı	GAS002S100
PureLink Genomik DNA Mini Kiti	Canlandırıcı	K182001
Puromisin Dihidroklorür	MP Biyomedikal A.Ş.	210055210
QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti	QIAGEN (Türkçe)	28704
Sıçan Anti-İnsan GM-CSF BV421	BD Ufuk	562930
RoboSep-S (RoboSep-S)	KÖK HÜCRE Teknolojileri	21000	Tam Otomatik Hücre Ayırıcı
Eylül Mate-50 (IVD)	KÖK HÜCRE Teknolojileri	85450
Sodyum Azide, %5 (a/h)	Ricca Kimya	7144.8-16
X-VIVO 15 Serumsuz Hematopoetik Hücre Ortamı	Fransa	04-418Ç