T Hücrelerinde Gen Düzenleme için Bir CRISPR-Cas9 Tekniği

Özet

Kaynak: Agarwal, S., et al. İnsan CRISPR Mühendisliğine Tabi CAR-T Hücrelerinin Üretimi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak insan T hücrelerinde gen düzenlemesi yapmak için bir testi göstermektedir. Birincil CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin bir karışımı, nakavt için spesifik genleri hedefleyen bir CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein kompleksi ile birleştirilir. Elektroporasyon üzerine, sgRNA, Cas9'u hedef DNA dizisine yönlendirerek hassas kesimler oluşturur. Bu kesikler daha sonra hücrenin homolog olmayan uç birleştirme mekanizması tarafından onarılır ve bu da gen nakavtına yol açar.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Birincil insan T hücrelerinde sgRNA'ların tasarımı ve gen bozulması

1. CRISPR sgRNA'ların
   tasarlanması not: Çeşitli sunucular ve programlar, hedefe özgü tek kılavuzlu RNA'ların (sgRNA) tasarımını kolaylaştırır. Bu protokolde, kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) sgRNA'ları, CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) ve Broad Institute'un (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) gRNA tasarım portalı kullanılarak tasarlanmıştır.
   1. Her hedef gen için, erken kodlama ekzon dizilerini hedeflemek için altı ila on sgRNA dizisi tasarlayın.
      NOT: sgRNA, yüksek hedef içi etkinliğe ve düşük hedef dışı etkinliğe sahip olmalıdır. sgRNA etkinliğini belirlemek için her makine öğrenimi algoritması biraz farklı çalışır. Bu nedenle, birden fazla sgRNA tasarım aracının karşılaştırılması ve tarama için altı ila on sgRNA'dan oluşan bir listenin oluşturulması önerilir.
2. Birincil insan T hücrelerinde gen bozulması
   1. Sağlıklı gönüllü donörlerden otolog periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) elde edin. Protokolün şematik bir zaman çizelgesi Şekil 1A'da açıklanmıştır ve aşağıda açıklanmıştır.
   2. Piyasada bulunan CD4 ve CD8 seçim kitlerini kullanarak CD4 + ve CD8 + T hücrelerini izole edin.
   3. CD4 + ve CD8 + T hücrelerini 1: 1 oranında birleştirin ve her biri 5 ng / mL insan interlökin-7 (huIL-7) ve insan interlökin -15 (huIL-15) ile desteklenmiş R10'da^{3x10 6} hücre / mL'de gece boyunca inkübe edin. IL-7 ve IL-15'in eklenmesi, merkezi bir hafıza fenotipini teşvik ettikleri ve IL-7 ve IL-15 ile genişletilmiş kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin, interlökin-2 (IL-2) genişletilmiş CAR-T hücrelerine kıyasla üstün anti-tümör etkinliğine sahip oldukları bilindiğinden önerilir.
   4. Ertesi gün, T hücrelerini sayın ve 5 dakika boyunca 300 x g'da 5-10 x 10⁶ hücreyi santrifüjleyin. Tüm süpernatanı atın ve hücre peletini azaltılmış serum minimal esansiyel ortamda yıkayın. Pelet, üreticinin talimatlarına göre 100 μL nükleofeksiyon çözeltisinde yeniden süspanse edin (Malzeme Tablosu).
   5. Hücreleri yıkarken, 10 μg Cas9 nükleazını 5 μg sgRNA ile oda sıcaklığında (RT) 10 dakika inkübe ederek CRISPR ile ilişkili protein 9 (Cas9) ve gRNA ile ribonükleoprotein (RNP) kompleksi hazırlayın. Cas9'un sgRNA'ya molar oranı 1:2.4'tür. Cas9 ve bir elektroporasyon arttırıcı içeren, ancak sgRNA içermeyen sahte bir kontrol önerilir.
      not: Multipleks gen düzenlemesi, bu adımda, her bir hedef için ayrı ayrı RNP kompleksleri yapılarak ve bir sonraki adımda açıklandığı gibi, nükleofeksiyon sırasında hücrelerle birleştirilerek gerçekleştirilebilir. RNP kompleksini bir araya getirmek için reaktifleri seçmek, yüksek nakavt (KO) verimliliği elde etmenin anahtarıdır. Örneğin, farklı satıcılardan gelen Cas9 nükleazları, değişen hedef dışı etkilere sahiptir ve kimyasal olarak modifiye edilmiş gRNA, T hücrelerine toksisiteyi azaltır, böylece KO verimliliğini artırır.
   6. Adım 1.2.4'ten yeniden süspanse edilmiş hücreleri adım 1.2.5'ten RNP kompleksi ile birleştirin ve 4.2 μL 4 μM elektroporasyon arttırıcı (insan genomuna homolog olmayan tek sarmallı DNA [ssDNA] oligonükleotidi) ekleyin. İyice karıştırın ve elektroporasyon küvetlerine aktarın. Elektroporasyon verimliliğini bozdukları için kabarcıklardan kaçının.
   7. Darbe kodu EH111 kullanarak hücreleri elektrostatik hale getirin. Elektroporasyondan sonra, 5x10'da 5 ng / mL huIL-7 ve huIL-15 ile takviye edilmiş R10'daki hücreleri, 12 oyuklu plakalarda 48 saat boyunca³⁰ ° C'de 6 hücre / mL'de inkübe edin. 48 saat sonra, T hücresi aktivasyonu ve genişlemesi ile devam edin.

Sonuçlar

Şekil 1. Düzenlenmiş CAR-T hücrelerinin genişlemesi ve popülasyonlarının iki katına çıkması. (A) Birincil insan CART hücrelerinde CRISPR düzenleme ve üretim zaman çizelgesi. (B) CAR-T hücrelerinin genişlemesi sırasında bir Coulter Sayacı kullanılarak ölçülen Sahte ve CRISPR ile düzenlenmiş CD19 CAR-T hücrelerinde Popülasyon İkiye Katlama (n = 3 sağlık...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
4D-Nükleofaktör Çekirdek Birimi	Fransa	AAF-1002B
4D-Nükleofaktör X-Birimi	Fransa	AAF-1002X
Cas9-Elektroporasyon arttırıcılar	Kimlik Bilgisi	1075915
CD4+ T hücre izolasyon kiti	Kök Hücre teknolojileri	15062
CD8+ T hücre izolasyon kiti	Kök Hücre teknolojileri	15063
Corning 0.45 mikron vakum filtresi / şişe	Corning	430768
Corning T150 hücre kültürü şişesi	Kırlangıç Sigma	CLS430825
DNAeasy Kan ve Doku Kiti	Keçi	69504
Glutamax takviyesi	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	35050061
HEPES (1 M)	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	15630080
huIL-15	PeproTech Teknolojisi	200-15
huIL-7	PeproTech Teknolojisi	200-07
Lipofektamin 2000	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	11668019
Opti-MEM	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	31985062
P3 Birincil hücre 4D-nükleofaktör X Kit L	Fransa	V4XP-3024
Penicilin-Streptomisin-Glutamin	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	10378016
RPMI1640	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	12633012
sgRNA Sertifikası	Kimlik Bilgisi
Casus Fi Cas9	Aldevron	9214

sayılı Kanun arası Serisi