$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Fare muhafazası ve bakımı
- 6-8 haftalık NSG fareleri satın alın (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
- Fareleri hava değişimi, ön filtreler ve yüksek verimli partikül hava (HEPA) filtreleri (0,22 μm) ile kontrollü sıcaklık, nem ve basınca sahip bir odada SPF koşulları altında barındırın.
- Fareleri, ön filtreler ve HEPA filtreler (0,22 μm) ile hava değişimini yönetebilen bir raf sisteminde otoklavlanmış ayrı mikroizolatör kafeslerinde barındırın ve bakımını yapın.
- Farelerin tüm prosedürlerini ve manipülasyonlarını, %2 etanol ile ön işleme tabi tutulmuş Sınıf II Tip A70 biyolojik güvenlik çeker ocakta gerçekleştirin. Hayvan odasında çalışmaya başlamadan önce duş alın ve temiz önlükler, Tyvek elbisesi, bot kılıfları, saç bonesi, yüz maskesi ve eldivenler giyin. Cerrahi işlemler sırasında Tyvek giysisinin üzerine ameliyat önlüğü giyin.
not: İşlemlerden önce ultraviyole (UV) ışık dekontaminasyonu da tercih edilir.
- Mümkünse tüm aletleri ve reaktifleri otoklavlayın ve ardından çeker ocaklara aktarmadan önce dezenfekte edin.
- Prosedürler sırasında, hayvanların ayrı ayrı havalandırılan kafeslerini raftan çıkarın ve çeker ocak'a aktarmadan önce dezenfekte edin.
- Fareleri ışınlanmış bir diyetle besleyin ve otoklavlanmış su sağlayın. Işınlanmış gıda sağlayın ve gerektiğinde ek ışınlanmış gıda ile takviye edin. Otoklavlanmış suyu haftalık olarak veya gerektiği gibi değiştirin.
not: Otoklavlanmış asitlenmiş su da kullanılabilir. Sağlanan ışınlanmış diyet, üretimden sonra 6 aylık bir raf ömrüne sahipti.
2. İnsanlaştırılmış kemik iliği, karaciğer ve timus (BLT) farelerinin nesli
NOT: Hu-BLT farelerin nesli daha önce tanımlanmıştır.
- Ameliyat gününde, farelere vücut ağırlığının 12 cGy / g dozunda tüm vücut ışınlaması yapın.
- Fareleri ameliyat için hazırlayın.
- Işınlanmış her fareye, anestezi için intraperitoneal (IP) enjeksiyonu ile vücut ağırlığına bağlı olarak fare başına 130-170 μL arasında değişen, 100 mg / kg çalışma konsantrasyonunda Ketamin ve 12 mg / kg konsantrasyonda Ksilazin karışımı verin. 3 ml Ketamin ve Ksilazin karışımı hazırlamak için, 100 mg / mL stok konsantrasyonunda 0.27 mL Ketamin ve 100 mg / mL ila 2.7 mL steril salin konsantrasyonunda 0.03 mL Ksilazin ekleyin ve iyice karıştırın. Enjeksiyondan önce cildi% 70 izopropanol ile dezenfekte edin.
- Uzun süreli ağrı yönetimi için her ışınlanmış fareye deri altı enjeksiyonla 1 mg / kg vücut ağırlığı (yarı canlı 72 saat, SR-LAB) Buprenorfin verin.
- Ameliyat öncesi antibiyotik profilaksisi için her ışınlanmış fareye IP enjeksiyonu ile 100 μL (858 μg) Cefazolin verin.
- Sol böbreği açığa çıkarmak için kullanılan daha sonraki cerrahi bölgede, farenin sol lateral ve medial tarafının etrafındaki elektrikli saç kesme makinelerini kullanarak farelerin saçlarını tıraş edin.
- Pedal refleksi (sert ayak parmağı sıkıştırması) ile uygun anestezi seviyesini doğrulayın.
- Ameliyat sırasında herhangi bir noktada ek anestezi gerekiyorsa% 3-5 oranında izofluran gazı verin.
- Kornea kurumasını önlemek için her iki göze de oftalmik merhem sürün. Gerekirse kulak küpesi takın.
- Karaciğer ve timus dokularını sol böbrek kapsülüne implante etmek için ameliyat yapın.
- Ameliyat bölgesinin merkezinden başlayarak dairesel bir şekilde dışarıya doğru iyotlu kese uygulayarak ameliyat bölgesindeki cildi dezenfekte edin. Bu işlemi %70 izopropanol ile ve üçüncü kez iyot ile tekrarlayın.
- Forseps kullanarak, önce bir insan fetal karaciğer dokusu parçasını bir trokara yükleyin. Daha sonra forseps kullanarak, bir insan fetal timus dokusu parçasını trokara yükleyin. Daha sonra forseps kullanarak, başka bir insan fetal karaciğer dokusu parçasını trokara yükleyin. Dokular, trokarın iç boyutlarına uyacak şekilde 1-1.6 mm3 oranında kesilmelidir.
- Cildi kaldırmak için forseps kullanın ve uzunlamasına küçük bir kesim yapmak için makas kullanın. Kesiği farenin sol tarafında 1,5-2 cm'ye kadar uzatın.
- Kas tabakasını kaldırmak için forseps kullanın ve uzunlamasına küçük bir kesim yapmak için makas kullanın. Böbreği ortaya çıkarmak için kesimi gerektiği kadar uzatın.
- Böbreği çevreleyen yağ dokusunu nazikçe kavrayarak böbreği açığa çıkarın. Böbrek parankimine doğrudan dokunmayın.
- Bir neşter kullanarak böbrek kapsülünün arka ucunda 1-2 mm'lik bir kesi yapın.
- Önceden yüklenmiş trokarı böbreğin uzun eksenine paralel kesiden yavaşça yerleştirin ve böbrek kapsülü ile böbrek arasındaki dokuları serbest bırakın.
- Böbreği ve bağırsağı dikkatlice normal pozisyonlarına getirin. Kas tabakasını kapatmak için 13 mm 3/8 daire iğne ile emilebilir 5/0 P-3 (P-13) sütürler ve cildi kapatmak için cerrahi zımbalar kullanın.
- Ameliyattan sonra, fareyi iyileşme için temiz, otoklavlanmış bir mikroizolatör kafesine koyun.
- Ameliyat sonrası iyileşme sırasında ısı kaybını en aza indirmek için, fareleri içeren kafesi, suyu ısıtan ve sirküle eden bir su pompasına bağlı bir ısıtma yastığına koyun.
- Fareleri, sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar izleyin.
- Ameliyatın tamamlanmasından sonraki 6 saat içinde, kuyruk damarı yoluyla, insan fetal karaciğer dokusundan izole edilen CD34 + hematopoetik kök hücreleri enjekte edin.
- Fareleri bir ısı lambası ile ısıtın. Kuyruğu %70 izopropanol ile dezenfekte edin ve ardından kuyruk damarına 1,5 ila 5 × 105 kök hücre / 200 μL enjekte edin.
- Enjeksiyondan kaynaklanan herhangi bir kanamayı durdurun ve fareleri mikroizolatör kafesine ve mikroizolatör kafesini kafes rafına geri koyun.
not: Ameliyat sonrası fareler tipik olarak, iyileşme sırasında ve sonrasında mikroizolatör kafesi başına beş adet olmak üzere bir araya getirilir. Bununla birlikte, fareler yalnızca hepsi aynı gün ameliyat olduysa bir araya getirilir.
- Fareleri günlük olarak kontrol edin. Cerrahi zımbaları dikkatlice izleyin ve gerektiğinde değiştirin. Fareleri herhangi bir enfeksiyon veya rahatsızlık belirtisi açısından yakından izleyin. Ameliyattan sonraki birkaç gün boyunca mikroizolatör kafesinin zeminine otoklavlanmış yiyecekler verin.
- Ameliyattan 7-10 gün sonra cerrahi zımbaları çıkarın. Fareleri uyuşturmak için% 3-5 oranında izofluran gazı verin. Zımbaları dikkatlice çıkarın ve ardından bölgeye antibiyotik ve ağrı giderici merhem sürün.
- İnsan bağışıklık hücrelerinin sulandırılması için 9-12 hafta bekleyin, daha sonra insanlaştırılmış farelerin her birinden medial safen veninden periferik kan toplayın.
- Nefes almak için farenin başının yanında bir açıklık ve bir bacağını izole etmek için farenin arkasına yakın bir açıklık bulunan uygun boyutta bir plastik koni tutucu kullanarak bilinçli fareleri kısıtlayın. Fareleri önce emniyet konisi kafasına koyun ve ardından bir bacağınızı bacak açıklığından nazikçe çekin.
- İzole edilmiş bacağın medial tarafına% 70 izopropanol püskürtün, ardından aynı bölgeye antibiyotik ve ağrı giderici merhem sürün.
not: Merhem, epilasyona gerek kalmadan damarın yerini ortaya çıkarmaya yardımcı olur ve ayrıca kan damlası oluşumuna yardımcı olur.
- 90° açıyla 25 gauge bir iğne kullanarak damarı delin ve etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kaplı bir kan alma tüpü kullanarak 50-100 μL kan toplayın. Steril gazlı bez ile bölgeye baskı uygulayarak kanamayı durdurun. Kanama durduktan sonra fareleri kafeslerine geri koyun.
not: Toplanan maksimum kan hacimleri tipik olarak haftada 50 μL veya iki haftada bir 100 μL'dir.
- hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19 için antikorlarla akış sitometrisi kullanarak insan bağışıklık hücresi sulandırma seviyesini test etmek için toplanan periferik kanı kullanın.
3. Antibiyotik tedavisi
- Antibiyotik tedavisinden önce, tedavi öncesi dışkı örnekleri toplayın. Fareleri yeni bir otoklavlanmış mikroizolatör kafesine taşıyın.
- Her gün geniş spektrumlu antibiyotiklerden oluşan taze bir kokteyl hazırlayın.
- Farelerin her mikroizolatör kafesi için taze hazırlanmış Metronidazol (1 g/L), Neomisin (1 g/L), Vankomisin (0,5 g/L) ve Ampisilin (1 g/L) içeren 250 mL su hazırlayın.
not: Antibiyotik takviyeli içme suyu için otoklavlanmış veya steril su kullanın.
- 250 mL antibiyotik takviyeli suya 9,2 g üzüm şekerli şekerli içecek karışımı ekleyin.
not: Üzüm şekeri, şekerli içecek karışımının kullanılması, antibiyotiklerin acı tadını maskeler ve farelerde dehidrasyonu önlemeye yardımcı olur.
- Antibiyotik ve üzüm şekerli şekerli içeceği değiştirin, takviye edilmiş suyu karıştırın ve fareleri her gün yeni bir otoklavlanmış kafese koyun.
not: Fareler koprofajiktir ve kafesleri günlük olarak değiştirmek, farelerin kendilerini bağırsak bakterileri ile yeniden aşılamasını önler.
- İnsan benzeri bağırsak mikrobiyomunun maksimum aşılanması için 14 gün boyunca antibiyotik sağlayın. Antibiyotik tedavisi sırasında, fareleri kilo kaybı ve dehidrasyon açısından izleyin. İlk 3-4 gün boyunca kilo kaybı beklenir ve bundan sonra tedavi süresince platolar beklenir. Dehidrasyon meydana gelirse, farelere intraperitoneal enjeksiyon yoluyla salin veya Ringers Solüsyonu verin.
not: Diğer bağırsak mikrobiyom insanlaştırma protokolleri, antibiyotiklerin oral gavajını gerektirir. Murin bağırsak bakterilerini tüketmede etkili olsa da, içme suyuna antibiyotik eklemenin daha az invaziv yönteminin insanlaştırılmış farelerimiz üzerinde daha az stres yarattığını ve daha iyi sonuçlara yol açtığını bulduk.
>4. Donör örnekleri ve dışkı nakli
- İnsan donörü dışkı örneklerini hazırlayın.
- İnsanlaştırılmış farelere dışkı nakli için uygun şekilde hazırlanmış dışkı mikrobiyota nakli (FMT) materyali kaynaklarını kullanın.
- FMT preparatlarını çözün ve anaerobik koşullar altında anaerobik bir odada ayırın.
- İstenirse, bu adımda tarafsız bir "insan" numunesi oluşturmak için dışkı numunelerinin eşit parçalarını karıştırın.
- FMT materyalinin donmasını ve çözülmesini minimumda tutun, numunelerin ayrılması veya karıştırılması gerekmiyorsa, sadece işlemden hemen önce çözdürün.
- İnsan dışkı nakli
- 14 günlük antibiyotik tedavisinin tamamlanmasından sonra, içme suyunu otoklavlanmış suya değiştirin ve fareleri yeni bir otoklavlanmış kafese taşıyın. Günlük kafes değişimlerini durdurun ve 1-2 haftada bir kafes değiştirme programı uygulayın.
- Antibiyotiklerin kesilmesinden 24 ve 48 saat sonra iki dışkı nakli yapın.
- Antibiyotik tedavisinden 24 saat sonra, gerekli miktarda FMT materyali çözülür ve her fareye oral gavaj yoluyla 200 μL FMT materyali verilir. Antibiyotiklerden 48 saat sonra işlemi tekrarlayın.
- Kalan veya arta kalan çözülmüş FMT materyalini insanlaştırılmış farelerin kürküne veya kafes yatağına yayın.