Çok Değerlikli Gösteren Bir Dış Membran Vezikül Aşısı Oluşturulması

Abstract

Kaynak: Feng, R., et al. SARS-CoV-2 reseptör bağlama alanını gösteren dış zar veziküllerine dayalı bir "tak ve görüntüle" nanopartikül aşı platformu. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu videoda, çok değerlikli dış zar vezikülü (OMV) aşıları oluşturmak için bir yöntem gösterilmektedir. Memeli hücreleri, bir SpyTag ve bir polihistidin etiketine kaynaşmış viral antijenleri eksprese etmek ve salgılamak için transfekte edilir. Bu antijenler daha sonra bir nikel-nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) afinite sütunu kullanılarak saflaştırılır. Saflaştırılmış antijen, yüzeye bağlı SpyCatcher (SC) proteinini eksprese eden dış zar vezikülleri ile karıştırılır. Çoklu antijenler, SpyCatcher'lara SpyTag'leri (ST) aracılığıyla kovalent olarak bağlanır ve antijeni gösteren OMV'ler oluşturur ve çok değerlikli bir aşı görevi görür.

Protocol

1. Plazmid yapımı

1. Daha önce yayınlanmış bir raporu takiben plazmid pThioHisA ClyA-SC'yi oluşturmak için BamH I ve Sal I bölgeleri arasına ampisiline dirençli bir pThioHisA-Cytolysin A (ClyA) plazmidine (Malzeme Tablosuna bakınız) SpyCatcher dizisini kodlayan DNA'yı (Şekil 1) yerleştirin.
2. Sentezlenmiş SpyTag-SARS-CoV-2 reseptör bağlama alanı (RBD)-polihistidin etiket (Histag) füzyon genini (Şekil 1) BamH I ve EcoR I bölgeleri arasında bir pcDNA3.1 plazmidisine (Malzeme Tablosuna bakınız) bağlayın daha önce yayınlanmış bir raporu takiben plazmit pcDNA3.1 RBD-ST'yi oluşturmak için.

2. OMV-SC hazırlığı

1. Aşağıdaki adımları izleyerek ClyA-SC dönüşümünü gerçekleştirin.
   1. 50 μL BL21 yetkin suşuna 5 μL pThioHisA ClyA-SC plazmit çözeltisi (50 ng/μL) ekleyin, hafifçe üfleyin ve 30 dakika buz üzerinde soğumaya bırakın.
   2. Solüsyonu 90 saniye boyunca 42 ° C'deki su banyosuna koyun ve ardından karışık solüsyonu hemen 3 dakika boyunca buzun üzerine koyun.
   3. Bakteriyel süspansiyona 500 μL Luria-Bertani (LB) ortamı ekleyin ve karıştırdıktan sonra 1 saat boyunca 37 ° C'de 220 rpm'de kültürleyin.
   4. Tüm dönüşümü ampisilin (100 μg/mL, Malzeme Tablosuna bakınız) içeren bir LB agar plakasına yerleştirin ve gece boyunca 37 °C.
      'de kültürleyin not: Daha sonraki deneylerde, ampisilin ortamda aynı konsantrasyonda tutuldu. Aksi takdirde, bu bakterilerde plazmit kaybına neden olabilir.
2. OMV-SC üretimi için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
   1. Tek bir koloniyi plakadan (adım 2.1.4.) ila 20 mL LB (ampisiline dirençli) ortamı izole edin ve gece boyunca 37 ° C'de 220 rpm'de kültürleyin.
   2. Bakteriyel çözeltiyi (adım 2.2.1'den itibaren) 2 L ortama aşılayın, 220 rpm'de, 37 ° C'de 5 saat boyunca logaritmik büyüme aşamasına kadar (OD₆₀₀nm 0.6 ila 0.8 arasındadır) kültürleyin.
   3. Bakteriyel çözeltinin 600 nm'deki OD'si 0.6-0.8'e ulaştığında, bakteriyel çözeltinin nihai konsantrasyonunu 0.5 mM yapmak için izopropil beta-D-tiyogalaktopiranosid (IPTG, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve ardından gece boyunca 25 ° C'de 220 rpm'de kültür.
3. OMV-SC saflaştırması gerçekleştirin.
   1. Bakteri çözeltisini 7.000 x g'da 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin.
   2. Süpernatanı 0,22 μm'lik bir membran filtre ile süzün, ardından 100 kD'lik bir ultrafiltrasyon membranı veya içi boş fiber kolon kullanarak konsantre edin (bkz.
   3. Konsantreyi 0.22 μm'lik bir membran filtreden süzün, ardından bir ultrasantrifüj kullanarak 2 saat boyunca 4 ° C'de 150.000 x g'da santrifüjleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve süpernatanı bir pipetle atın.
   4. Yağışı PBS ile tekrar askıya alın ve -80 °C'de saklayın. Çözelti, -80 °C'de uzun süreli stabiliteyi koruyabilir.

3. RBD-ST hazırlığı

1. Aşağıdaki adımları izleyerek RBD-ST transfeksiyonunu gerçekleştirin.
   1. Uygun bir ökaryotik ekspresyon sistemi seçin (örneğin, HEK293F) ve iyileşmeden sonra hücreleri gece boyunca 37 ° C'de 130 rpm'de kültürleyin.
   2. Otomatik hücre sayacına 20 μL HEK293F hücre çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız), hücre sayısını kaydedin, konsantrasyonu 1 x 106 hücre / mL'ye ayarlayın ve ardından hücreleri 4 saat boyunca 37 ° C'de 130 rpm'de kültürleyin.
   3. RBD-ST plazmitini 0.22 μm'lik bir membran filtreden süzün ve son hacim 10 mL olana kadar hücre kültürü ortamına 300 μg plazmit ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız); 10 saniye çalkalayın.
   4. Polietilenimi (PEI, 1 mg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) su banyosunda 65 ° C'ye ısıtın, 0.7 mL PEI'yi 9.3 mL hücre kültürü ortamı ile karıştırın ve 10 s.
      not: Çözeltiyi kuvvetlice sallamayın. Aksi takdirde, ortaya çıkan kabarcıklar transfeksiyon verimliliğini etkileyebilir.
   5. PEI çözeltisine plazmit çözeltisi ekleyin, karışımı aralıklı olarak 10 saniye çalkalayın ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
   6. Karışımı 280 mL hücre kültürü ortamına ekleyin ve 5 gün boyunca 37 ° C'de 130 rpm'de kültürleyin.
2. RBD-ST saflaştırması gerçekleştirin.
   1. Hücreleri 20 dakika boyunca 25 ° C'de 6.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı toplamak için bir pipet kullanın.
   2. Sütunu 2 mL Ni-NTA agaroz ile doldurun (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 3x PBS ile 3x yıkayın.
   3. 20 mM'lik son konsantrasyonu elde etmek için hücre süpernatanına imidazol ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve hücre süpernatantını 2x yükleyin.
   4. Yıkama için 20 mM imidazol içeren 3 sütun hacmi (CV) PBS ekleyin ve yıkama fraksiyonunu toplayın.
   5. Düşük ila yüksek konsantrasyonlar içeren 3 CV PBS ile gradyan elute (ör., 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M) imidazol; her konsantrasyon için 2x elute.
   6. RBD-ST'yi farklı konsantrasyon gradyanlarında tanımlamak için SDS-PAGE'i kullanın.

>4. OMV-RBD biyokonjugasyon ve saflaştırma

1. Biskinkoninik asit tahlili (BCA) yöntemiyle protein konsantrasyonunu belirleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
   1. Standart sığır serum albümini (BSA) protein çözeltisini 2 mg / mL'den 0.0625 mg / mL'ye seri olarak seyreltin, saflaştırılmış OMV-SC ve RBD-ST 10x'i seyreltin, daha sonra BCA çalışma çözeltileri A ve B'yi karıştırın (test kitinde verilir) 50: 1 (h / h) oranında.
   2. Seyreltilmiş protein çözeltisi (25 μL / oyuk) ekleyin ve BCA çalışma çözeltisi (200 μL / kuyu) ile karıştırın; 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
   3. Her bir kuyucuğun 562 nm'deki absorbansını (OD) ölçün ve standart eğriden protein konsantrasyonunu hesaplayın.
2. Aşağıdaki adımları izleyerek OMV-SC ve RBD-ST'nin biyokonjugasyonunu gerçekleştirin.
   1. OMV-SC ve RBD-ST'yi PBS'de 40:1 (a/a) oranında karıştırın.
   2. Karışımı gece boyunca 15 rpm'de 4 °C'de karıştırmak için dikey olarak döndürün.
      not: Farklı antijenler farklı oranlarda reaksiyona girebilir. Antijenin özelliklerine bağlı olarak farklı reaksiyon oranları denenebilir.

Results

Şekil 1: Bu çalışmada kullanılan plazmit dizileri.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampisilin sodyum	Sangon Biyoteknoloji	A610028
Otomatik hücre sayacı	Sayım Yıldızı	Biyoteknoloji
BCA protein miktar tayin kiti	cwbio	CW0014S
Elektroforez aparatı	Cavoy (Mağara)	Güç BV
Yüksek hızlı dondurma santrifüjü	Biyolojik sırt	H2500R Serisi
His-Tag fare mAb	Hücre sinyalizasyon teknolojisi	2366'lar
İmidazol	Sangon Biyoteknoloji	A600277
İzopropil beta-D-tiyogalaktopiranosid	Sangon Biyoteknoloji	A600118
Ni-NTA His-Bind Süper Akışı	Keçi	70691
OPM-293 hücre kültürü ortamı	Opm biyolojik bilimler	81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plazmidi	Wuhan genecreat biyolojik teknolojisi
Fosfat tampon tuzlu su	ZSGB-biyografi	ZLI-9061
Polietilamin Lineer	Poli Bilimler	23966-1
Önceden boyanmış protein merdiveni	Termo	26616
pThioHisA ClyA-SC plazmidi	Wuhan genecreat biyolojik teknolojisi
Quixstand tezgah üstü sistemler (100 kD içi boş fiber kolon)	GE sağlık hizmetleri
SDS-PAGE yükleme arabelleği (5x)	Beyotime	P0015 Serisi
Sodyum klorür	Sangon Biyoteknoloji	A100241
Süspansiyon aleti	Yaşam Teknolojisi	Hula Karıştırıcı
Tripton	Oksoit	LP0042B
Ultrasantrifüj	Beckman coulter	XPN-100
Ultraviyole spektrofotometre	Hitachi	U-3900
Maya özü	Sangon Biyoteknoloji	A610961