$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
Allojenik reaksiyonları incelemek için Balb/cYJ (H2d) donör fareleri ve C57Bl/6 (H2b) alıcı fareleri kullanın. Fareler, 8 ila 12 haftalık yaşlar arasındaki deneyler için kullanılır. Dişi veya erkek fareler kullanın. Sinjeneik kontroller, C57Bl / 6 donörlerinden C57Bl / 6 alıcılarına kadar aort segmentlerinden oluşur.
1. Donör ve Alıcı Hazırlığı
NOT: Greftin iskemisini en aza indirmek için hem verici hem de alıcı ameliyattan önce uyuşturulur ve hazırlanır. Enjekte edilebilir anestezikler, inhale anesteziklerin verilmesi için gerekli ekipman tarafından hayvanın tıkanmasını önlemek için protokolde kullanılır. Bununla birlikte, istenirse, inhale anestezik uygun bir alternatiftir. Anesteziklerin ilk enjeksiyonundan itibaren, tüm prosedürün tamamlanması yaklaşık 90 dakika sürer. Greftin iskemik süresi 30 dakikadan azdır.
- Fareyi intraperitoneal ketamin (100 mg / kg; 10 mg / ml) ve ksilazin (10 mg / kg; 1 mg / ml) enjeksiyonları ile uyuşturun. Fare 10 ila 15 dakika içinde sakinleştirilecektir. Hayvan ayak pedinin yağlı kısmını sıkıştırarak anestezi derinliğini değerlendirin. Anestezik kokteylin orijinal dozunun 1 / 3'ünü, hayvan geri çekilme refleksi göstermeyene kadar gerektiği gibi uygulayın. Her kokteyl uygulandıktan sonra solunum hızını yakından izleyin. Ameliyat sırasında, karın ön duvarını bir çift forseps ile sıkıştırarak her 15 dakikada bir anestezi seviyesini değerlendirin. Fareler 60 ila 90 dakika boyunca derin anestezi altında kalmalıdır.
- Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için farenin gözlerini oftalmik bir merhemle yağlayın.
- Göğüs kafesinin ortasından pubise kadar abdominal ventral bölgede cilde mümkün olduğunca yakın tüyleri tıraş edin. Herhangi bir cildi çentiklememeye özellikle dikkat edin. Tüy dökücü krem kullanmayın çünkü cilt tarafından emilebilir ve iltihaplı olabilir.
- Hayvanı sırtüstü olarak ısıtma masasının veya yastığının üzerindeki bir havluya yerleştirin.
- Ameliyat bölgesini %2 kloroheksidin içeren bir ön ovma ile temizleyin. Cerrahi alanı en üst düzeye çıkarmak için geniş bir çalışma alanı hazırlayın. Ameliyat bölgesinin merkezinde ovmaya başlayın ve doğrusal veya dairesel olarak dışarıya doğru hareket edin. Gazlı bezi atın. Bu işlemi en az 5 kez daha tekrarlayın. Aynı bölgeye bir alkol hazırlama pedi uygulayın. Alkol kuruduktan sonra, temiz alanı Betadine solüsyonu ile hazırlayın ve steril gazlı bezle örtün.
2. Uçtan Uca Anastomoz Prosedürü
- Donör Operasyonu
- Operasyon boyunca aseptik bir teknik sürdürün. Kullanmadan önce tüm tezgah ve ameliyat masası yüzeylerini %0,5 hızlandırılmış hidrojen peroksit solüsyonu ile temizleyin. Kullanmadan önce tüm cerrahi aletleri, gazlı bezleri, örtüleri ve önlükleri sarın ve otoklavlayın. Her pakete yerleştirilmiş bir buhar sterilizatör gösterge şeridi ile aletlerin sterilliğini doğrulayın. Ameliyatlar arasında steril cerrahi eldivenler kullanılır ve atılır. Birden fazla ameliyat için, cerrahi aletleri kullanımlar arasında sıcak cam boncuk sterilizatörü ile sterilize edin.
- Donör fareyi, ameliyat mikroskobu altında 8-30X büyütmede steril bir örtü ile sarılmış temiz, ince bir Pleksiglas tahta üzerine sırtüstü yerleştirin.
- Bölüm 1.1'de belirtildiği gibi yeterli cerrahi anesteziyi sağladıktan sonra ameliyata devam edin.
- Steril makas kullanarak, pubisten ksifoid sürecine kadar tek bir orta hat alt uzunlamasına abdominal insizyon yapın.
- Küçük bir ekartör kullanarak boşluğu ortaya çıkarmak için karın duvarlarını açın.
- Steril pamuk uçlu aplikatörler kullanarak, bağırsakları hayvanın soluna doğru nazikçe geri çekin ve tuzlu su çözeltisi ile nemlendirilmiş gazlı bezle örtün. Üreme organlarını inferior olarak hareket ettirin ve infrarenal aortu ve inferior vena kava'yı (IVC) bulun. Maruz kalan dokuları periyodik olarak tuzlu su çözeltisi ile nemlendirin.
- Tıbbi No. 5 forsepslerini kullanarak, aortu IVC'den, sol renal arter seviyesinden bifurkasyona kadar ayırın. Aorta yakın küçük dalları bağlamak için 10-0 poliamid monofilament sütürler kullanın.
- Donörün aortu IVC'den ayrıldıktan sonra, damarı salinle doyurun, açıkta kalan boşluğu nemli gazlı bezle örtün ve donörü steril bir alanda bir kenara koyun. Her 15 dakikada bir donörün durumunu (solunum ve kardiyovasküler fonksiyon ve anestezi derinliği) kontrol edin. Aortu aşağıda açıklandığı gibi izole ederek alıcı üzerinde çalışmaya başlayın (Adım 2.2.1 ila 2.2.7).
- Alıcı aort IVC'den ayrıldıktan ve bir kenara bırakıldıktan sonra, donörü mikroskop altına geri koyun. Çapraz klemp (ilgilenilen segmentin proksimal ve distal) donör aortunu, yaklaşık 5 mm aralıkla, iki adet 4 mm'lik mikrovasküler klemp ile.
- Vannas-Tübingen mikromakasını kullanarak, abdominal aortun küçük bir greft segmentini (3 ila 4 mm uzunluğunda) kesin.
- Bir şırıngaya bağlı 25 G 5/8'lik bir iğne kullanarak, eksize edilen aortu heparinize (100 U / ml) salin solüsyonu ile yıkayın. İğne ucunun damar ile temas etmediğinden emin olun.
- Aortu buz üzerinde heparinize (100 U/ml) salin solüsyonuna koyun ve bir kenara koyun. Hala derin anestezi altındayken, mikrovasküler klempleri serbest bırakın. Kan kaybı ile donöre ötenazi yapın.
- Donör damarı eksizyondan sonraki 30 dakika içinde implante edin. Aortun daha büyük bir uzunluğunu eksize ederek birden fazla alıcı için bir donör damar kullanmak mümkün olsa da, iskemik süreyi 30 dakikadan daha az tutun.
- Alıcı İşlemi
- Donör operasyonunda olduğu gibi operasyon boyunca aseptik bir teknik sürdürün.
- Alıcı fareyi, ameliyat mikroskobu altında 8-30X büyütmede steril bir örtü ile sarılmış ince bir Pleksiglas tahta üzerine sırtüstü yerleştirin.
- Yeterli anesteziyi sağladıktan sonra, hayvan geri çekilme refleksi göstermediğinde ameliyata devam edin.
- Steril makas kullanarak, pubisten ksifoid sürecine kadar tek bir orta hat alt uzunlamasına abdominal insizyon yapın.
- Küçük bir ekartör kullanarak boşluğu ortaya çıkarmak için karın duvarlarını açın.
- Steril pamuk uçlu aplikatörler kullanarak, bağırsakları hayvanın soluna doğru nazikçe geri çekin ve tuzlu su çözeltisi ile nemlendirilmiş gazlı bezle örtün. Üreme organlarını aşağı doğru hareket ettirin ve infrarenal aort ve IVC'yi bulun. Maruz kalan dokuları periyodik olarak tuzlu su çözeltisi ile nemlendirin.
- Aortu IVC'den, sol renal arter seviyesinden bifurkasyona kadar ayırın. Gerekirse aort yakınındaki küçük dalları bağlamak için 10-0 poliamid monofilament sütürler kullanın.
- Çapraz klemp (ilgilenilen segmentin proksimal ve distal) aort, yaklaşık 5 mm aralıkla, iki adet 4 mm mikrovasküler klemp ile.
- Vannas-Tübingen mikromakasını kullanarak, tek bir yatay aortotomi yapın ve donör aort greftini yerleştirmek için abdominal aortun küçük bir segmentini (en fazla 0,5 mm) rezeke edin.
- Eksize edilen aortu heparinize (100 U / ml) salin solüsyonu ile yıkayın. Donör aort grefti, alıcının kesilen aort uçlarını bağlamak için uygun uzunlukta olmalıdır.
- Donör aort greftini ortotopik pozisyona yerleştirin ve donörün greft ucunu, ilgili greft anatomik oryantasyonunu alıcınınkiyle eşleştirerek alıcının ucuna anastomoz edin.
- Damarın tunika eksternasını nazikçe kavrayın ve tıbbi No.5 forsepslerini kullanarak hafifçe itin. Forseps kullanarak, 10-0 poliamid monofilament sütürüne bağlı iğneyi, donör aort greftini alıcının rezeke edilen damarına sabitlemek için damar duvarının tam kalınlığı boyunca sürün. Teknenin arka duvarının yanlışlıkla dikilmesi nedeniyle kap açıklığının kapatılmadığından emin olun.
- Sürekli dikişler için, greftin hem üst hem de alt uçlarına saat 9 konumunda kalan dikişleri yerleştirin. Greftin üst ucundan saat 3 pozisyonundan başlayarak, rezeke edilen uçları 2 koşu sütürü ile anastomoz edin ve sütürü kalıcı sütüre sabitleyin.
- Grefti ters çevirin ve damarın dorsal kısmına doğru akan sütişe devam edin, orijin kalış sütürünü karşılayın. Gemiye fazla baskı uygulamadan sabitleyin. Alt anastomoz için dikişi tekrarlayın.
Not: Kesilen dikişler, sürekli dikişlerle aynı şekilde başlar, ancak kalan dikişler arasında damar üç ayrı dikişle anastomoz edilir. Anastomoz süresi genellikle 20 dakikadır.
- Anastomoz tamamlandıktan sonra, retrograd kanın akmasına izin vermek için distal mikrovasküler klempi serbest bırakın ve anastomozlu bölgelerin sızıntısını kontrol edin. Bir sızıntı varsa, arızalı bölgeyi kapatmak için hemen bir dikiş yerleştirin. Bölgelerde kanama yoksa, proksimal kelepçeyi serbest bırakın.
- Nakli inceleyin ve greftte ve alıcının damarının proksimal ve distal kısımlarında kan tıkanıklığı olup olmadığını kontrol edin. Vericinin ve alıcının damarlarındaki güçlü bir nabız paterni, kanın serbestçe aktığını gösterir. Forseps çiftini kullanarak, kalan dikişlerin bir ucunu nazikçe kavrayın ve damarın arka duvarını incelemek için damarı hafifçe sallayın.
not: Anastomoz yapılan bölgelerin her iki ucunda damar duvarında büzüşme olmamalıdır. Kelepçelerin çıkarılmasından sonra zayıf kan akışı trombozun bir işaretidir.
- Pamuk uçlu aplikatörler kullanarak bağırsakları karın boşluğuna geri koyun.
- Castroviejo iğne tutucu ve Graefe forseps ile karın duvarını sürekli dikiş kullanarak 5-0 polipropilen sütürlerle kapatın. Cilt tabakasını aynı dikişlerle subkutiküler kapatma kullanarak kapatın.
- Torbugesic (1 mg / kg) i.m. nakil tamamlandıktan hemen sonra.
- Hemen, sırayla, Atipamezol (1 mg / kg), ketoprofen (5 mg / kg) ve ısıtılmış Laktasyonlu Ringer çözeltisini deri altından verin.
- Ameliyattan hemen sonra, fareleri gece boyunca (12 saat) bir su battaniyesinin altında ısıtılmış bir kafese koyun. Anestezi-iyileşme döneminde, hayvanları tek başına temiz, kuru ve engelsiz bir alana yerleştirin. Kafesi (otoklavlanmış) temiz kağıt havlularla hizalayın ve su battaniyesinin sıcaklığını yaklaşık 20 ila 22 °C'ye ayarlayın. Kafes tabanında kuru ve ıslak kuru mama taneleri ad libitum sağlayın.
not: Ameliyat sonrası bakımın önemli bir bileşeni, anestezi ve cerrahiden iyileşme sırasında hayvanı gözlemlemek ve gerektiğinde uygun müdahaledir. Gerekli izleme yoğunluğu hayvana göre değişecektir ve hemen anestezik iyileşme döneminde, ameliyat sonrası iyileşmeye göre daha sonra daha yüksek olabilir.
- Anestezi görmüş hayvanları tamamen iyileşene kadar sürekli olarak izleyin. Hayvan, yardımsız sternal yaslanmayı sürdürebilmeli ve gözetimsiz bırakılmadan önce sakin ve ağrısız görünmelidir.
- Her ikisi de deri altından üç gün boyunca Buprenorfin (0.1 mg / kg BID) ve ketoprofen (5 mg / kg SID) verin.
- Anesteziden iyileşme sırasında kardiyovasküler ve solunum fonksiyonunu, vücut ısısını ve ameliyat sonrası ağrı veya rahatsızlığı en az üç gün izleyin. Dehidrasyonu ve elektrolit kaybını en aza indirmek için analjezikler ve diğer ilaçlar ve parenteral sıvıların uygulanması gibi ek bakım gerekebilir.
- Arka bacakların motor fonksiyonunu gözlemleyerek nakil ameliyatının başarısını değerlendirin. Nakilin tam başarısı, hayvanın iyileşmesinden hemen sonra olması gereken arka bacak ve kuyruğa engelsiz kan akışını ve ikinci gün arka bacaklarda felç olmadan tam iyileşmeyi içerir.