$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Bacillus Calmette-Guerin (BCG) Danimarka ve Mycobacterium tuberculosis H37Rv'nin Kantitatif Gliserol Stoklarının Hazırlanması
>NOT: Açıklanan tüm protokoller biyo-güvenlik seviye-3 (BSL3) koşulları altında gerçekleştirilmiştir.
- BCG Danimarka veya H37Rv suşlarının donmuş gliserol stoklarını çözün ve Tween-80 %0.05 (h/h) ve ADC (Albümin, Dekstroz, Katalaz) %10 (h/h) ile takviye edilmiş 10 ml 7H9 ortamında 100 μl'yi aşılayın.
- Kültür log fazında büyüyene kadar 37 ° C'de bir hafta boyunca statik koşullar altında inkübe edin.
- 10 ml'lik kültürü 200 ml taze ortama aktararak bakteri kültürünü ölçeklendirin. Statik koşullar altında 20 gün daha inkübe edin.
- 50 ml'lik santrifüj tüplerine aktarın ve 2500 x g'da 15 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanları atın ve kalan hacimdeki bakteri peletini yeniden süspanse edin. Her tüpe 3 mm çapında steril cam boncuklar ekleyin (tüp başına 10 - 15 adet).
- Bakteri kümelerini ayırmak için 1 dakika kuvvetlice girdaplayın. Her peleti 10 ml fosfat tamponlu salin (PBS) içinde Tween-80 %0.05 (h/h) ile yeniden süspanse edin.
- Tüpleri 10 dakika bekletin, en büyük bakteri agregalarının ve cam boncukların yerleşmesine izin verin.
- Küçük kümeler ve tek bakteri içeren 4 tüpün her birinden 9.5 ml süpernatan geri kazanın ve hacimleri tek bir taze 50 ml'lik santrifüj tüpüne aktarın (son geri kazanılan hacim 38 ml). 400 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
- Tek bir taze 50 ml'lik santrifüj tüpünde 35 ml süpernatan (esas olarak tek bakteri içeren) geri kazanın ve gliserol ile 15 ml PBS ekleyin% 50 (h / v), % 15'lik bir nihai gliserol konsantrasyonu elde edin.
- Yavaşça karıştırın ve dondurmak için uygun tüplerde 1 ml'lik alikotlar halinde dağıtın. -80 ° C'de saklayın (bir parti yaklaşık 50 alikot gliserol stoğu sağlar).
- Gliserol stoklarını ölçmek için, dondurulduktan bir gün sonra gliserolü çözün ve 900 μl PBS içeren ayrı 1.5 ml'lik tüplerde yedi on kat seri seyreltme gerçekleştirin.
- 55 mm çapında Petri kaplarında hazırlanan ADC %10 (h/h) ile desteklenmiş 7H10 katı-agar ortamında her seyreltmenin 100 μl'lik plakası.
- Dikkatlice 3 mm çapında cam boncuklar ekleyin (plaka başına yaklaşık 10 tane) ve hacmi agar plakası üzerine eşit olarak dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın. Boncukları atın ve agar plakasını parafilm ile kapatın.
- 37 ° C'de 21 gün boyunca inkübe edin ve tek kolonilerin doğru bir şekilde ayırt edilebildiği seyreltmelerde koloni oluşturan birimleri (CFU) sayarak bakteri konsantrasyonunu belirleyin.
2. Fare Aşısı
- Önceden ölçülmüş bir BCG gliserolünü çözün ve iki süspansiyon hazırlamak için PBS'de seyreltin. Hayvan başına dozun deri altı uygulama için 100 μl (deri altı aşılama için ml başına 107 CFU) ve intranazal uygulama için 40 μl (burun içi aşılama için 2.5 x 107 CFU) olduğunu düşünerek nihai hacmi hesaplayın.
- Fareleri izofluran ve oksijen karışımı ile uyuşturmak için kemirgenler için özel bir anestezi iş istasyonu kullanın. Anesteziyi indüklemek için% 5 ve fareleri anestezi odasında tutmak için% 2 izofluran kullanın. (Kabul edilen diğer anestezi yöntemleri kullanılabilir).
- Deri altı aşı uygulaması için, 1 ml'lik bir şırıngayı 1 ml bakteri süspansiyonu (10,7 CFU / ml) ile 26 G'lık bir iğne ile doldurun. Hava kabarcıklarını çıkarın.
- Anestezi uygulanmış bir fareyi, laminer akış başlığının içine yüzüstü pozisyonda düz bir yüzeye yerleştirin ve farenin sırtının bir tarafına deri altından 100 μl (106 CFU / doz) aşı aşılayın. Fareyi kafese geri koyun ve anesteziden düzgün bir şekilde iyileştiğinden emin olmak için izleyin.
- Her fare uygulaması arasında şırınga iğnesini değiştirin. Yukarıda açıklandığı gibi hava kabarcıkları çıkarıldı.
- İntranazal uygulama için, anestezi uygulanmış bir fareyi başlığın içine sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
- Bir mikropipet ile 2,5 x 107 CFU/ml ile 20 μl süspansiyon alın. Tüm hacim birikene kadar aşıyı iki burun deliği arasına damla damla yerleştirin ve farenin hacmi solumasına izin vermek için damlalar arasında zaman bırakın.
NOT: fareler bu prosedür sırasında solunum sıkıntısı çekebilir, bu nedenle mümkün olduğunca önlemek için bir sonrakini uygulamadan önce her damlayı özümsemek için bırakılmalıdırlar.
- Mikropipeti 20 μl ile tekrar doldurun ve işlemi tekrarlayın. Fare ilk aşılamadan sonra anesteziden uyanmaya başlarsa, ikincisinden önce anestezi odasına yerleştirin. Fareyi kafese geri koyun ve anesteziden düzgün bir şekilde kurtulduğundan emin olun.
>3. H37Rv Suşu ile Fare İntranazal Zorluğu
- Önceden ölçülmüş bir H37Rv gliserolünü çözün ve ml başına 2.500 CFU'luk bir bakteri süspansiyonu hazırlamak için PBS'de seyreltin. Hayvan başına dozun 40 μl olduğunu göz önünde bulundurarak nihai hacmi hesaplayın.
- H37Rv, 2.5 - 2.7'de tarif edildiği gibi intranazal olarak aşılanır. Fare başına son zorluk dozu 102 CFU / 40 μl'dir.