Bir Sıçan Modelinde Yaygın Serebral Kortikal Demiyelinizasyonun Oluşturulması

Özet

Kaynak: Üçal, M. ve ark., Pro-inflamatuar Sitokinlerin İntraserebral Enjeksiyonu ile İndüklenen Yaygın Serebral Kortikal Demiyelinizasyonun Sıçan Modeli. J. Vis. Uzm. (2021)

Video, yaygın serebral kortikal demiyelinasyona sahip bir sıçan modeli oluşturmak için bir yöntemi göstermektedir. Bu, rekombinant miyelin kılıf proteini ile astarlanmış farelere pro-inflamatuar sitokinler enjekte ederek kan-beyin bariyerini bozmayı içerir. Bu işlem, bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonunu kolaylaştırır ve yaygın serebral kortikal demiyelinizasyon ile sonuçlanır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Malzeme Hazırlama

NOT: Ameliyat aseptik koşullar altında gerçekleştirilir. Başlamadan önce, matkap uçları da dahil olmak üzere tüm cerrahi aletlerin uygun bir dezenfektanla temizlendiğinden emin olun.

1. Anestezik bir karışım hazırlayın: 0.02 mg / mL fentanil, 0.4 mg / mL midazolam ve 0.2 mg / mL medetomidin (karışımdaki son konsantrasyonlar).
   NOT: Alternatif anestezikler için ilgili Tartışma bölümüne bakın.
2. Bir panzehir karışımı hazırlayın: 0.07 mg / mL flumazenil ve 0.42 mg / mL atipamezol (karışımdaki son konsantrasyonlar).
3. Kateteri ve kateter kapağını giriş ve vida ile monte edin. Kateteri bir neşter ile 2 mm uzunluğunda kesin (Şekil 1).
   NOT: Kateter ucunun dairesel kesit şeklini sıkıştırıp bozdukları için bunun için makas kullanmayın.

2. Cerrahi Hazırlık

1. Anestezik karışımın (1.5 mL / kg vücut ağırlığı) intraperitoneal uygulamasıyla sıçanı uyuşturun.
2. Elektrikli tıraş makinesini kullanarak farenin başını kulakların arasında tıraş edin. Ameliyat boyunca hipotermiyi önlemek için hayvanı yerleştirmeden önce stereotaktik çerçeveye homeotermik bir battaniye yerleştirin.
3. Kulak çubuklarını ve ısırma plakasını kullanarak farenin kafasını stereotaktik çerçevede hareketsiz hale getirin, başın yatay ve sabit olduğundan emin olun. Kafatasına parmak veya forseps ile baskı uygulayarak stabiliteyi kontrol edin.
   NOT: Stereotaktik çerçeve içinde gevşek bir sabitleme ve yatay olmayan konumlandırma, amaçlanan koordinatlardan sapmaya neden olabilir.
4. Ameliyat sırasında kornea kuruluğunu önlemek için kayganlaştırıcı göz damlaları uygulayın. Herhangi bir cerrahi ışığa maruz kalmayı önlemek için gözleri opak bir malzemeyle kapatın.
5. % 70 etanol ve% 10 povidon-iyot kompleksi uygulamasını değiştirerek traşlı alanı temizleyin.
   NOT: Enfeksiyonu önlemek için ameliyat sırasında tüm ihtiyati tedbirleri alın. Ameliyat aseptik koşullar altında yapılır. Asepsi bozulursa, kontamine materyalin değiştirilmesi gerekir.

3. Kateter İmplantasyonu

1. Kafa derisinin ortasında yaklaşık 2 cm uzunluğunda uzunlamasına bir kesi yapın. Cildi yanlara doğru tutmak için bulldog kelepçeleri kullanın. Bu adımlara genel bir bakış için Şekil 2'ye bakın.
2. Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak kanı alın.
3. Kafatası periosteumunu çıkarın. Dokuyu pamuk uçlu aplikatör ile temizleyin ve kafatası kemiğini ortaya çıkarın. Kafatasının yaklaşık 1 dakika kurumasını bekleyin.
4. Anatomik yer işaretlerini, Lambda, Bregma ve medial sütürü tanımlayın. Matkap stereotaktik çerçeveye takılıyken, matkap ucunu başlangıç noktası olarak Bregma'ya yerleştirin. Bregma'dan 2 mm posterior hareket ettirin ve medial sütüre lateral olarak ~2.4 mm hareket ettirin.
5. Bu konumda kateter için 0,5 mm çapında bir delik açın. Kemik tozunu nazikçe üfleyin.
   NOT: Delme sırasında dura materin sağlam kalması önemlidir. Bunu sağlamak için, 1) stereotaktik çerçeveye takılabilen bir matkap kullanın, 2) delme sırasında deliği sık sık inceleyin ve 3) küçük adımlarla detaylandırın. Kafatasına çok fazla basınç uygulanırsa, kafatasına tam olarak girildiğinde matkap ucu beyne girmeye devam edecek ve beyne zarar verecektir.
6. Ankraj vidaları için ilk delikten birkaç milimetre uzakta 3 delik daha (~1.3 mm çapında) açın. Kemik tozunu nazikçe üfleyin.
   NOT: Kateter üst kısmı (~2 mm çapında) ve ankraj vida üst kısımları (~1 mm) için yeterli alan sağlayan ankraj vidası konumlarını seçin.
7. Bir şırınga kullanarak yaklaşık 1-2 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) veya fizyolojik tuzlu su ile sulama yaparak kemik tozunu alın. Kafatasını temizleyin. Ankraj vidalarını 2 - 3 tam tur sıkın.
   NOT: Ankraj vidaları, diş çimentosunu ve dolayısıyla kateteri yerinde tutarak kurulumu stabilize etmek için gereklidir. Bir ankraj vidasını sıkarken, forseps ile hafifçe yukarı doğru kaldırarak kolayca çıkarılmadığından emin olun. Kateterin implantasyonu doku travmasına neden olduğundan, ankraj vidalarını delerken veya sıkarken ek dura yaralanması birden fazla travmatik yaralanmaya yol açacak ve muhtemelen bir grup içinde karşılaştırılabilirliği engelleyecektir. Önce ankraj vidalarını sıkın ve en son kateteri yerleştirin.
8. 2 mm uzunluğundaki kateteri kafatası yüzeyine dik olacak şekilde ilk delikten yerleştirin. Kateteri hala içeride tutarken, biraz diş çimentosu uygulayın ve kateteri stabilize etmek için diş kürleme ışığına kısa bir süre (~ 5 sn) maruz bırakarak polimerize olmasına izin verin, bu da bir sonraki adımda her iki elin kullanımına izin verir.
   Dikkat: Diş kürleme ışığı ile çalışırken, doğrudan uca veya uygulama alanından yansıyan ışığa bakmaktan kaçının, çünkü bu ışığın yüksek yoğunluğu retina hasarına neden olabilir. Uygun koruyucu gözlük kullanın.
9. Kateterin etrafına daha fazla diş çimentosu sürün, vidaları sabitleyin ve diş çimentosunu diş kürleme ışığı (~ 15 - 30 s) ile katılaştırın. Çimentonun sertleşmesini bir forseps ucuyla onaylayın.

4. Yaranın Kapatılması ve Anestezinin Antagonize Edilmesi

1. Baş derisini, kateterin ön ve arka kısımlarında emilebilir dikişlerle kapatın.
   NOT: İmplantasyon sonunda kafatası üzerinde inişli çıkışlı bir kurulum olacağı için yara kapanışını buna göre yapınız. Cildi çok fazla kaldırmak, hayvan için rahatsızlığa neden olur.
2. Panzehir karışımını 26 G iğneli 1 mL'lik bir şırınga kullanarak deri altına (1.5 mL / kg vücut ağırlığı) enjekte edin.
3. Profilaktik antibiyotik tedavisi için enrofloksasin (% 2.5) subkütan enjeksiyonla (7.5 mg / kg vücut ağırlığı) uygulayın. Deri altı enjeksiyonu ile ağrının giderilmesi için carprofen (1 mg / mL; 5 mg / kg vücut ağırlığı) ve buprenorfin (1.2 mg / kg) uygulayın.

5. Ameliyat Sonrası Bakım ve İlaç Tedavisi

1. Hayvanı modifiye edilmiş kafese geri koyun ve hipotermiyi önlemek için kızılötesi ışık uygulamasıyla 1 - 3 saat gözlem altında tutun. Ameliyat sonrası iyileşmeye kadar her 5 ila 10 dakikada bir hayvanı sürekli olarak gözlemleyin ve yeniden konumlandırın. İyileşene kadar gözlere sürekli ışığa maruz kalmaktan kaçınmak için özel dikkat gösterin.
2. Ameliyattan sonraki gün deri altı enjeksiyonlarla enrofloksasin (7.5 mg / kg vücut ağırlığı) ve carprofen (1 mg / mL; 5 mg / kg vücut ağırlığı) uygulamalarını tekrarlayın. Önceki tedavi 72 saat boyunca etkili olduğu için buprenorfinin tazelenmesi gerekli değildir.

6. Bağışıklama Karışımının Hazırlanması (Kateter İmplantasyonundan En Erken 14 Gün Sonra)

NOT: Hazırlama prosedürü sırasında şırıngaları buzun üzerine yerleştirin.

1. İki adet 10 mL Luer kilit uçlu cam şırıngayı 3 bir vananın kısa kollarına bağlayın ve üçüncü çıkışı uzun kolla kapatın.
2. Bağlantıların sağlam ve sızdırmaz olduğundan emin olun: piston 2'yi tutarken açık şırıngaya yaklaşık 4 mL steril PBS ekleyin. Piston 1'i takın ve sızıntı olup olmadığını kontrol ederken her iki pistonu da ileri geri itin. Sızıntı olmazsa, PBS'yi atın ve piston 1'i tekrar çıkarın.
3. 1 mL eksik Freund adjuvanı (IFA) ve 50 μg rekombinant miyelin oligodendrosit glikoproteinini (rMOG_1-125) birlikte pipetleyin ve karışımı uygun bir tüpte steril PBS (pH 7.4) ile 2 mL'lik son hacme ayarlayın.
   NOT: Hazırlık sırasında şırıngaların uçlarında veya duvarlarında emülsiyon kayıpları nedeniyle, uygulama için amaçlanandan daha büyük bir hacim hazırlayın. Aynı anda 1'den fazla hayvan için hazırlık yapmak da benzer şekilde daha pratiktir.
4. Seyreltilmiş IFA ve rMOG_1-125 karışımını açık şırıngaya yerleştirin. Karşı piston üzerinde gevşek bir basınç sağlarken pistonu nazikçe yerleştirin (Şekil 3A).
5. Pistonları beyaz ve viskoz olana kadar ileri geri iterek aşıyı bir şırıngadan diğerine sürerek emülsifiye edin (Şekil 3B).
6. 1 mL'lik bir Luer kilit şırıngasını 3 vananın açık kısa koluna sabitleyin ve aşı ile doldurun (Şekil 3C). Tüm aşıları 1 mL'lik şırıngalara dağıtın. Enjeksiyona kadar buz üzerinde tutun. Karışımı hazırlık gününde uygulayın.

>7. Bağışıklama

1. Sıçanı bir odada izofluran ile anestezi altına alın (~ 2 dakika, oksijen 2 L / dak ile karıştırılmış) ve daha sonra anesteziyi bir maske ile (oksijen 1.5 L / dak ile karıştırılmış) sürdürün.
2. 21 G'lik bir iğne kullanarak kuyruk tabanına deri altına 200 μL aşı enjekte edin.
   NOT: Çözelti viskoz olduğu için enjeksiyonu yavaşça uygulayın.

8. İntraserebral Sitokin Enjeksiyonu

1. Konektör kanülünün uzunluğunu (2 mm) ayarlayın. (Hazırlık adımları için Şekil 4'e bakın.)
2. 1 mL'lik bir şırıngayı sitokin karışımı ile doldurun (steril PBS'de 500 ng / μL tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-alfa), 300 U / μL rekombinant sıçan interferon-gama (IFN-gama)). Şırıngayı bir konektör kanülüne bağlayın. Kanülü sitokin karışımı ile doldurun. Herhangi bir baloncuktan kaçının.
3. Şırıngayı programlanabilir şırınga pompasına monte edin ve 0.2 μL/dak enjekte edecek şekilde programlayın (Şekil 5A). Kanülün ucunda hava kabarcığı oluşmasını önlemek için pompayı çalıştırın ve çalışır durumda tutun.
   NOT: Enjeksiyon hızı, kullanılan spesifik şırınganın iç çapını dikkate almalıdır; Bu nedenle, pompa kurulumu sırasında şırınga çapının kaydedilmesi gerekir.
4. Sıçanı bir odada izofluran ile uyuşturun (~ 2 dakika, 2 L / dakika oksijen ile karıştırılmış) ve ardından anesteziyi bir maske (1.5 L / dakika oksijen ile karıştırılmış) ile sürdürün (Şekil 5B ve 5C). Hayvan en az 30 dakika boyunca uyuşturulacağı için kayganlaştırıcı göz damlası uygulayın.
5. Girişli kateter kapağını çıkarın. Konektör kanülünü katetere yerleştirin ve vidalayın ve sıkın (Şekil 5D ve 5E).
   NOT: Kateterin üst ucunu tahrip edeceği için aşırı sıkmayın.
6. Enjeksiyonun 10 dakika devam etmesine izin verin (toplam enjeksiyon hacmi 2 μL'dir). Pompayı durdurun. Enjekte edilen hacmin tamamen dağılmasını sağlamak için kanülü kateterin içinde 20 dakika
bekletin.
7. Konektör kanülünü sökün ve vakum etkisini önlemek için yavaşça çıkarın.
8. Kateter kapağını girişe tekrar takın ve vidalayın. Hayvanın bir kafeste anesteziden kurtulmasına izin verin.

Sonuçlar

Şekil 1: Kateterin hazırlanması. (A ve B) Kılavuz kanül ve kukla kanül (girişli kateter kapağı) monte edilir ve vidalanır. (C) Daha sonra kateter bir neşter yardımıyla 2 mm boyutunda kesilir. Mikroskobik gözlem, bu amaçla makas kullanımının kanül ucunun dairesel şeklini bozduğunu ve bu nedenle kaçınılması gerektiğini gösterdi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Yetişkin erkek Dark Agouti sıçanları (300 ±25 g)
Fentanil	Hameln pharma plus, Almanya		Fentanil-Sitrat olarak, 50 μg/ml
Midazolam	ERWO Pharma, Avusturya	50039017	5 mg / ml
Medetomidin	Orion Pharma, Finlandiya		Medetomidin hidroklorür olarak, 1mg / ml
Flumazenil	Roche, İsviçre		0.1 mg / ml
Atipamezol	Orion Pharma, Finlandiya		Atipamezol hidroklorür olarak, 5 mg / ml
% 10 povidon-iyot kompleksi	Mundipharma, Avusturya
Diş çimentosu	Heraeus Kulzer, Almanya	6603 7633
Fizyolojik tuzlu su çözeltisi	Fresenius Kabi, Avusturya		% 0.9 NaCl
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Sigma-Aldrich, Almanya	P3813 Serisi
İzofloran	AbbVie, Avusturya
Kayganlaştırıcı göz damlası	Thea Pharma, Avusturya
% 70 EtOH	Merck, Almanya	1070172511	Mutlak etanol, %70 v/v hazırlanması için ddH2O içinde seyreltildi
% 2.5 Enrofloksasin	Bayer, Almanya		Profilaktik antibiyotikler
Carprofen Teknolojisi	Pfizer, Amerika Birleşik Devletleri		Ağrı kesiciler, 50 mg/ml
Ara-20	Sigma-Aldrich, Almanya	P9416
Pentobarbital	Richter Pharma, Avusturya		Pentobarbital sodyum, 400 mg / ml
İnterferon gama	PeproTech, Amerika Birleşik Devletleri	400-20
Tümör nekroz faktörü alfa	Ar-Ge Sistemleri, ABD	510-RT-050/CF
rMOG1-125	İsveç Karolinska Enstitüsü Moleküler Tıp Merkezi'nde kendi ürünü		Rekombinant sıçan miyelin oligodendrosit glikoproteini, N-terminalinden 1-125 amino asitleri, ayrıca ticari olarak temin edilebilir: AnaSpec, AS-55152-500, ABD
Eksik Freund'un adjuvanı	Sigma-Aldrich, Almanya	F5506
Sığır serum albümini	Sigma-Aldrich, Almanya	A9576
Peroksidaz substrat çözeltisi	Vektör Laboratuvarları, ABD	SK-45000
Stereotaktik çerçeve	David Kopf Instruments, ABD
Kateterler, MRG uygun	PlasticsOne, Amerika Birleşik Devletleri	8IC315GPKXXC
Kukla kanüller	PlasticsOne, Amerika Birleşik Devletleri	8IC315DCNSPC
Plastik vidalar, MRG'ye uygun	PlasticsOne, Amerika Birleşik Devletleri	8L080X093N01
Bağlayıcı kanül	PlasticsOne, Amerika Birleşik Devletleri	8IC313CXSPCC
2 mm uç boyutuna sahip tornavida
Esnek şaft uzatmalı matkap	Proxxon, Almanya	NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620,
Matkap ucu, yuvarlak, 0,5 mm	Hager & Meisinger, Almanya	REF310 104 001 001 009
Matkap ucu, bükülmüş, 1,3 mm	Hager & Meisinger, Almanya	REF350 104 417 364 013
neşter	Braun, Almanya	BB510
Neşter sapı	Güzel Bilim Araçları, Almanya	91003-12
Pamuk uçlu aplikatör	Henry Schein Medikal, Avusturya	900-3155
Cerrahi makas	Güzel Bilim Araçları, Almanya	14101-14, 14088-10
Cerrahi forseps	Güzel Bilim Araçları, Almanya	11002-12, 11251-35
Bulldog kelepçeleri	Güzel Bilim Araçları, Almanya	18050-35
Homootermik battaniye	TSE sistemleri, Almanya
Kızılötesi Lamba	Beurer, Almanya	616,51
Diş kürleme ışığı	Guilin Ağaçkakan Medikal, Çin
Emilebilir sütür	Johnson & Johnson, Belçika	V792E Serisi
Programlanabilir şırınga pompası	Dünya Hassas Aletler, ABD	AL-1000
Sınav eldivenleri
Cerrahi önlük
Elektrikli Tıraş Makinesi	Aesculap, Almanya	GT420
Uçucu anestezik buharlaştırıcı	Rothacher Medikal, İsviçre	Özgeçmiş 30-301-D
Uçucu anestezik buharlaştırıcı için oksijen kaynağı	Air Liquide, Avusturya	19.113
Uçucu anestezi odası	Rothacher Medikal, İsviçre	PS-0347
Sıçanlar için anestezi maskesi	Rothacher Medikal, İsviçre	PS-0307-A
1 ml şırınga	Codan, Danimarka	REFERANS 62.1612
Enjeksiyon için 26 gauge iğne	Braun, Almanya	4657683
Sitokin enjeksiyonu ve bağışıklama için 20 gauge iğne	Braun, Almanya	4657519
Luer kilit uçlu cam şırıngalar	Poulten & Graf, Almanya	7.140-37
3 musluk	Becton Dickinson, İsveç	394600
37°C kuluçka makinesi	Kendro, Almanya	50042301
Mikropipetler	Gilson, Amerika Birleşik Devletleri	F167350