Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Sterilizasyon
- Kafaları toplamadan önce temiz forseps alarak ve 200 ° C'de 1 saat boyunca bir fırında kuru ısı sterilizasyonu yaparak forsepsleri dezenfekte edin. Tüm cam malzemeleri kullanmadan önce 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavlayın.
- Açıklanan tüm çalışmaları bir mikrobiyoloji sınıf 2 kabini içinde gerçekleştirin. Tüm reaktifleri üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
2. Örnek toplama
- Mezbahada, Swaledale kuzuları elektrik veya esir cıvatalı tabanca kullanılarak bayıltılarak kesildi ve kan cezasına çarptırıldı. Kesimden en fazla 4 saat sonra kuzu kafalarını toplayın.
3. Kafaların hazırlanması
- Numune alanına yaklaşık 100 mL 200 ppm klor dioksit solüsyonu dökerek kuzunun alın kısmını dezenfekte edin. Başın alın kısmını elektrikli makas kullanarak tıraş edin ve alanı 200 mL 200 ppm klor dioksit solüsyonu ile yıkayın.
- Alanı etanol ve mavi rulo ile silin ve örnek alanı 35 dakika boyunca tüy dökücü kremle kaplayın. Bir kazıma aleti kullanarak tüy dökücü kremi nazikçe kazıyın ve örnek alanı değerlendirin. Önemli miktarda saç kalırsa, epilasyon işlemini tekrarlayın.
- Alanı durulamak için 200 mL daha klor dioksit çözeltisi kullanın ve ardından etanol ile durulayın ve mavi bir rulo ile silin.
- Steril 8 mm'lik bir biyopsi zımbası kullanarak, hazırlanan alandan 8 mm'lik cilt örneklerini kesin. Steril forseps ve 15 bıçaklı bir neşter kullanarak numuneleri çıkarın ve tüm cilt yağının alındığından emin olun.
- Numuneleri steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurulmuş steril 0,5 L'lik bir kavanoza koyun ve ardından 50 mL 200 ppm klor dioksit çözeltisi içeren steril 50 mL'lik tüplere aktarın, iki kez ters çevirin ve 30 dakika sterilize etmeye bırakın.
- Numuneleri klor dioksit çözeltisinden çıkarın ve 40 mL steril PBS ile doldurulmuş 50 mL'lik bir tüpe koyarak yıkayın. Yıkandıktan sonra, her bir cilt örneğini 24 oyuklu bir plakanın ayrı bir kuyusuna yerleştirin.
- Numuneyi hava-sıvı arayüzünde tutarken 350 μL önceden ısıtılmış ortam ekleyin. Ortamın bileşimi aşağıdaki gibidir: MK ortamı (Hanks tuzları, L-glutamat ve 1.75 mg / mL sodyum bikarbonat içeren Orta 199) ve Ham'ın F12'si 1: 1 oranında, fetal sığır serumu (FBS,% 10 v / v), epidermal büyüme faktörü (EGF, 10 ng / mL), insülin (5 μg / mL), penisilin-streptomisin (100 U / mL), ve amfoterisin B (2.5 μg/mL).
- 24 oyuklu plakaları gaz geçirgen bir plaka contası ile kapatın ve 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 doku inkübatöründe 24 saate kadar inkübe edin.
>4. Deri örneklerinin bakımı
- İnkübasyondan sonra, kültür ortamını çıkarın ve numuneleri 500 μL steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde durulayın. Her numuneye antibiyotik içermeyen ortam ekleyin ve numunedeki kalıntı antibiyotikleri uzaklaştırmak için nemlendirilmiş %5 CO2 doku inkübatöründe 37 °C'de 24 saat inkübe edin.
- 24 saat sonra antibiyotik içermeyen ortamda bulanıklık veya mantar enfeksiyonu gelişirse, numuneyi atın.
5. Aşının hazırlanması
- 10 mL steril triptik soya suyu ile 50 mL'lik bir tüp hazırlayın. Taze bir agar plakası S. aureus alın ve birkaç koloniyi et suyuna aktarmak için bir bez kullanın. 37 °C'de 150 rpm'de 18 saat inkübe edin.
- 3 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 10 mL steril PBS'de yeniden süspanse edin. Hücrelerin yeterli şekilde yıkanmasını sağlamak için iki kez tekrarlayın.
- İnokulumu steril PBS'de 0.6 OD600'e ayarlayın. Manuel olarak uygulanabilir bir plaka sayımı yaparak aşılama yükünü onaylayın.
6. Deri örneklerinin enfeksiyonu
- 400 μL önceden ısıtılmış antibiyotik içermeyen ortam içeren 24 oyuklu yeni bir plaka hazırlayın ve steril forseps kullanarak 24 oyuklu eklere ekleyin.
- Besiyerini cilt örneklerinden çıkarın, 500 μL steril PBS ile yıkayın ve yıkamayı çıkarın. Numuneyi kuyunun dibine nazikçe tutmak için steril forseps kullanın.
- 1-2 mm'lik kaba bir derinliğe kadar delici merkezi bir yara flebi yapmak için 4 mm'lik bir punch biyopsisi kullanın. Ardından, yara flebinin üst tabakasını çıkarmak için 15 bıçaklı bir neşter ve steril dişli allis dokusu forseps kullanın. Yara boyutlarındaki değişkenlik, enfeksiyonun sonucunu ve son nokta koloni oluşturan birimleri (CFU) etkileyebilir.
- Tüm numuneler yaralandıktan sonra, steril forseps kullanarak 24 oyuklu eklere aktarın. Yara yatağına 15 μL bakteri aşısı pipetleyin. Daha sonra, nemlendirilmiş% 5 CO2 doku inkübatöründe 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
- Daha uzun inkübasyon süreleri gerekiyorsa, besiyerini çıkarın ve her 24 saatte bir yeni besiyeri ile değiştirin ve aynı koşullarda inkübe edin.
