Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. İnsan NK Hücre Saflaştırma ve Genişletme
- Buffy Coat'tan periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) izole edin.
- 35 mL buffy coat örneğini 15 mL Ficoll-Paque üzerine katmanlayın.
- Frensiz 20 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin ve PBMC'yi arayüzden toplayın.
- Geri kazanılan PBMC'leri en az eşit hacimde PBS ekleyerek, 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyerek ve PBC yıkamasını aspire ederek üç kez yıkayın. NK hücresi bu aşamada RosettesSep ile izole edilebilir.
- 0, 7 ve 14. günlerde ışınlanmış 10 x10 6 mbIL21 eksprese eden besleyici hücrelerle uyararak NK hücrelerini genişletin. Ortamı, her gün tüm ortam hacmi için %10 FBS, %1 Glutamin, %1 Penisilin Streptomisin ve 100 IU/mL IL-2 içeren taze RPMI ile değiştirin.
2. gRNA Tasarımı ve Seçimi
- Çevrimiçi araçları kullanarak hedeflenecek spesifik genomik lokusları seçin, örneğin, NCBI, Ensemble.
örnek.
Açıklama: Transforme edici büyüme faktörü beta reseptörü 2 (TGFBRR2) ektodomain
Kaydı görüntüle: PF08917
InterPro'yu Görüntüle: IPR015013
Pozisyon: 49 - 157 aa
Hedeflenen Dizi: TGFBR2 geninin Ekzon 4'ü (ENSG00000163513)
- gRNA'ları tasarlamak için http://crispr.mit.edu ve 'Benchling' gibi CRISPR tasarım web araçlarını kullanın.
- Adım 2.1'de seçilen DNA dizisini girin. Hedef genom olarak insanı (hg 19) seçin. CRISPR kılavuzları (20 nükleotid ve ardından bir protospacer bitişik motif (PAM) dizisi: NGG) daha önce girilen diziden taranacaktır. Ayrıca, seçilen genom boyunca olası hedef dışı eşleşmeleri de gösterir.
- Hedef içi ve hedef dışı oranlarına göre en yüksek puana sahip en iyi üç gRNA'yı seçin. Örneğin, Tablo 1, CRISPR tasarım web araçları tarafından önerilen TGFBR2 geninin ekzon 4'ünü hedeflemek için tasarlanmış CRISPR RNA'larını göstermektedir.
- CRISPR RNA'larını sentetik diziye özgü crRNA'lar olarak sipariş edin.
- crRNA ile kısmi homoloji yoluyla etkileşime girmek için korunmuş, transaktive edici bir RNA (tracrRNA) sipariş edin.
3. Tasarım Silme Tarama Primerleri
- T7E1 mutasyon testi için gRNA bölünme bölgelerini kapsayan primerler tasarlayın.
- Mutasyon testini takiben sgRNA hedef bölgesindeki küçük ekleme-silmenin (indels) %1.5 agaroz jel üzerinde görünmesini sağlamak için tahmin edilen bölünme bölgesinden en az 100 bp uzakta primerler kullanın. Tablo 2, TGFBR2 ektodomainini amplifiye etmek için kullanılan primerleri göstermektedir.
4. İnsan Birincil ve Genişlemiş NK Hücrelerinin Transdüksiyonu
Not: Cas9/RNP elemanlarının NK'ya transdüksiyonu, aşağıdaki gibi 4D sistem kullanılarak elektroporasyon ile yapılır.
- Hücre Hazırlama
- Birincil NK hücreleri için, yeni izole edilmiş NK hücrelerini Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamında 100 IU / mL IL-2 varlığında 4 gün boyunca inkübe edin ve elektroporasyonu 5. günde gerçekleştirin. Ortamı daha önce açıklandığı gibi her gün ve transdüksiyondan bir gün önce değiştirin.
- Genişlemiş NK hücreleri için, hücreleri 0. günde 1: 1 oranında ışınlanmış besleyici hücrelerle uyarın ve elektroporasyonu 5. veya 6. veya 7. günde gerçekleştirin. Ortamı daha önce açıklandığı gibi her gün ve transdüksiyondan bir gün önce değiştirin.
- Elektroporasyon gününde, elektroporasyon uygulanan hücreler için 100 IU/mL IL-2 içeren 8 mL taze RPMI ile doldurulmuş bir T25 şişesi hazırlayın ve şişeleri nemlendirilmiş 37 °C ve% 5 CO2 inkübatörde ön inkübe edin.
not: Çözülmüş hücreler veya 2. veya 3. stimülasyon görmüş hücreler, tarif edildiği gibi iyileşmelerinden sonra herhangi bir zamanda elektropore edilebilir.
- 26 μL transdüksiyon karışımı için koşul başına 3 - 4 × 106 hücre alın.
not: Elektroporasyon çözeltisindeki çok yüksek konsantrasyondaki NK hücreleri, iletim hızını arttırır.
- Yaygın olarak RNaz aktivitesi içeren tüm FBS'yi çıkarmak için hücreleri PBS ile 3 kez yıkayın. Her seferinde 300 x g'da 8 dakika döndürün.
not: Cas/RNP'ler için tek gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) ve iki gRNA'nın (gRNA1+gRNA2, gRNA1+gRNA3, gRNA2+gRNA3) bir kombinasyonu olarak 7 elektroporasyon koşulunu düşünün ve Cas9/RNP'siz bir kontrol.
- crRNA'yı oluşturun:tracerRNA/kompleks
- crRNA'ları (gRNA1, gRNA2 ve gRNA3) ve izleyiciRNA'yı 1x TE çözeltisinde 200 μM'lik nihai konsantrasyonlara yeniden süspanse edin. Her 200 μM gRNA'nın 2.2 μL'sini Tablo 3'te gösterildiği gibi 200 μM izleyiciRNA ile karıştırın.
- Numuneleri 95 °C'de 5 dakika ısıtın ve tezgah üstünde oda sıcaklığına (15 - 25 °C) soğumaya bırakın. Yeniden süspanse edilmiş RNA'ları ve crRNA: tracrRNA/kompleksini daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de saklayın.
- RNP kompleksini oluşturun
Not: Zaman kazanmak için, yıkama adımı 4.1.5 sırasında RNP kompleksini oluşturun.
- Tek crRNA: tracrRNA dubleks reaksiyonu için, Cas9 endonükleazı Tablo 4'teki örnekte gösterildiği gibi 36 μM'ye seyreltin.
- crRNA: tracrRNA duplekslerinin kombinasyon transdüksiyonu için, Cas9 endonükleazını Tablo 5'teki örnekte gösterildiği gibi 36 μM'ye seyreltin.
- CrRNA'ya Cas9 endonükleaz ekleyin: tracrRNA, pipet ucunu 30 saniye ila 1 dakika arasında döndürürken yavaşça duplekslenir.
- Karışımı oda sıcaklığında 15-20 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra karışımı kullanmaya hazır değilse, karışımı kullanana kadar buz üzerinde tutun.
- Elektroporasyon
- Tüm takviyeyi elektroporasyon çözeltisi P3'e ekleyin ve oda sıcaklığında tutun.
- Hücre peletini (3 - 4 × 10,6 hücre, adım 4.1.5'ten itibaren) 20 μL P3 birincil 4D elektroporasyon çözeltisinde yeniden süspanse edin. Pipetleme sırasında hava kabarcıklarından kaçının.
Not: Hücreler P3 çözeltisinde uzun süre bırakılmamalıdır.
- Hemen hücre süspansiyonuna 5 μL RNP kompleksi (Adım 4.3) ekleyin.
- Cas9 / RNP'ler / hücre karışımına 1 μL 100 μM Cas9 elektroporasyon arttırıcı ekleyin.
- Cas9 / RNP'ler / hücre karışımını 20 μL elektroporasyon şeritlerine aktarın.
- Numunenin şeritlerin altını kapladığından emin olmak için şeritlere hafifçe vurun.
- 4D elektroporasyon sistemini başlatın ve EN-138 programını seçin.
Tablo 1. TGFBR2 ektodomaininin ekzon 4'ünü sentetik crRNA olarak hedeflemek için tasarlanmış üç gRNA.
| gRNA HAYIR. | gRNA dizisi | Sentetik crRNA olarak sipariş edilir |
| gRNA1 | 5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3 | /AltR1/rArGrUrCrArGrUrArGrArGrUrUrGrGrUrArGrCrUrUrGrCrUrUrGrCrU/AltR2/ |
| gRNA2 | 5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3 | /AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrCrArCrArGrArGrArCrUrArCrGrUrArGrCrUrUrGrCrU/AltR2/ |
| gRNA3 | 5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3 | /AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2/ |
Tablo 2. TGFBR2 ektodomain genini amplifiye etmek için kullanılan primerler
| TGFBR 2 ektodomain Primerleri FWD | 5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3 |
| TGFBR2 ektodomain Astar REV | 5 GGG CCT TIKAÇ AAT CTG KEDI TTA 3 |
Tablo 3. 200 μM RNA kullanarak crRNA:tracrRNA/kompleksini oluşturun
| parça | Tutar (uL) |
| 200 μM crRNA | 2.2 |
| 200 μM İzleyici RNA | 2.2 |
| IDTE Tamponu | 5,6 |
| Nihai ürün | 10 |
Tablo 4. Tek crRNA: tracrRNA dubleks reaksiyonu için, Cas9 endonükleazını 36 μM'ye seyreltin.
| parça | Miktar (μL) |
| Pbs | 1 |
| crRNA:tracrRNA dubleks (adım 4.2'den itibaren) | 2 (200 pmol) |
| Alt-R Cas9 endonükleaz (61 μM stok) | 2 |
| Toplam hacim | 5 ul |
Tablo 5. crRNA'nın kombinasyon transdüksiyonu için: tracrRNA dupleksleri Cas9 endonükleazını 36 μM'ye seyreltir.
| parça | Miktar (μL) |
| Pbs | 1 |
| crRNA:tracrRNA dubleks (ör. gRNA1) | 1 (100 pmol) |
| crRNA:tracrRNA dubleks (ör. gRNA2) | 1 (100 pmol) |
| Alt-R Cas9 endonükleaz | 2 |
| Toplam hacim | 5 μL |
