$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Ters Genetik ile Rekombinant Canlı Zayıflatılmış İnfluenza Aşılarının Üretilmesi
>NOT: Ters genetik ile rekombinant influenza virüslerinin üretilmesi için ayrıntılı protokol önceki çalışmalar tarafından tanımlanmıştır ve bu raporun kapsamı dışındadır. Kısaca, soğuğa uyarlanmış grip aşılarının (CAV) kurtarılması, biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL2) muhafazası altında bir biyogüvenlik sınıf II kabininde yapılır ve aşağıda ayrıntıları verilen adımları içerir.
- Arka plan olarak soğuğa uyarlanmış A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2) suşunun yanı sıra A / PR / 8/34 (H1N1) suşunun hemaglutinin (HA) ve modifiye edilmiş bir nöraminidaz (NA) kullanarak reassortant soğuğa uyarlanmış bir influenza aşısı oluşturun (Şekil 1A). NA genindeki modifikasyon, protein sapındaki (65 ila 72 kalıntılar) korunmuş bir dizinin, tavuk ovalbümini (OVA) türetilmiş peptit SIINFEKL'i kodlayan kısa bir cDNA dizisi ile PCR bazlı bir şekilde değiştirilmesinden oluşur (Şekil 1B). SIINFEKL peptidi, C57BL / 6 farelerinin H-2b MHC sınıf I kısıtlı yanıtı bağlamında oldukça immünodominant bir peptittir.
- % 1 penisilin / streptomisin (P / E) ile desteklenmiş DMEM% 10 fetal sığır serumu (FBS) kullanarak% 1 6 293T hücresi 6 oyuklu plakalarda 6 293T hücresi.
- Plazmit transfeksiyon karışımını hazırlayın: İnfluenza A/Ann Arbor/6/60 suşundan PB2, PB1, PA, NP, M, NS için cDNA'ları kodlayan plazmitlerin her birinden 1 μg ve influenza A/PR/8/34'ten NA-SIINFEKL ve HA'yı kodlayan 1 μg plazmit ekleyin. Önceden ısıtılmış Opti-minimal esansiyel ortam (Opti-MEM) (100 μl/kuyucuklu son hacim için 15 μl) ekleyin.
- Transfeksiyon karışımını RT'de 30 dakika inkübe edin.
- 100 μl transfeksiyon karışımı/kuyusu ekleyin ve 37 ° C ve% 5 CO2'de 16 saat inkübe edin.
- Hücre ortamını 5 saat boyunca DMEM, %0,3 BSA, 33 °C'de %1 F/K ve %5 CO2 ile değiştirin.
- L-1-Tosilamid-2-feniletil klorometil keton (TPCK-tripsin) ile muamele edilmiş sığır pankreasından 1 μg/ml tripsin içeren dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 106 influenza izin veren Madin-Darby Köpek Böbreği (MDCK) hücresi ekleyin. 293T-MDCK ko-kültürlerini 33 ° C ve% 5 CO2'de 2 - 3 gün koruyun.
- MDCK-293T hücre ko-kültürlerinin süpernatantlarını toplayın ve 5 dakika boyunca 260 x g'da santrifüjleme ile temizleyin.
