Tümör Sferoidlerinde Sızan T Hücrelerinin Üç Boyutlu Ko-Kültür Modeli

Özet

Kaynak: Lin, Y., et al. 3D Kültürde Kanser Hücresi İstilasının ve T Hücresi Sitotoksisitesinin İzlenmesi. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu videoda, üç boyutlu bir tümör sferoidi ve T hücresi ko-kültürü oluşturmak için bir yöntem gösterilmektedir. Tümör sferoidleri içeren mikrokuyucuklara sahip bir agaroz dökümü hazırlanır, ardından T hücrelerinin eklenmesi takip edilir. İnkübasyondan sonra, bu kurulum, kontrollü bir üç boyutlu ortamda T hücrelerinin tümör sferoidleri ile etkileşiminin incelenmesine izin verir.

Protokol

1. Sferoidlerin üretimi

1. 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde %2 agaroz hazırlayın ve otoklavlayın (ör., 50 mL 1x PBS'de 1 g agaroz) ve otoklav 35 ve 81 mikrokuyulu kauçuk kalıplar.
   Dikkat: İmmünohistokimya (IHC) işlemi için agaroz kalıpları oluşturmak için düşük erime noktalı agaroz kullanmaktan kaçının.
2. Agaroz dökümleri hazırlayın
   NOT: 35 mikrokuyu dökümleri, invazyon, immünofloresan (IF) ve hücre izolasyon testleri için kullanılır. 81 mikrokuyu dökümleri sitotoksisite, IHC, hücre izolasyonu ve ribonükleik asit (RNA) ekstraksiyon testleri için kullanılır.
   1. Agaroz otoklavlandıktan sonra, erimiş agarozu yaklaşık 60\u201270 °C'ye kadar soğumaya bırakın. Bir hücre kültürü davlumbazında, aseptik teknik kullanın ve 500 μL erimiş agarozu kuyu başına 81 mikrokuyulu kauçuk kalıba veya 330 μL'yi kuyu başına 35 mikrokuyulu kauçuk kalıba pipetleyin.
      Dikkat: Agarozu karıştırırken veya pipetlerken kabarcık oluşturmaktan kaçının. Hafifçe pipetleyerek baloncukları çıkarın.
   2. Agaroz katılaştıktan sonra, agaroz dökümünü çıkarmak için kauçuk kalıbı dikkatlice esnetin. Bu vesileyle, ellerinizi uygun kuyu plakasının üzerine koyun ve agarozun kuyu plakasının bir kuyusuna düşmesine izin verin.
      not: Aşırı esnemeyi önlemek için kauçuk kalıbı farklı konumlarda esnetin. Kauçuk kalıbı esnetmek ve aynı anda alttan nazikçe itmek yardımcı olabilir.
   3. Agaroz kalıplarını dengelemek için,% 10 fetal sığır serumu (12 oyuklu plaka için 2.5 mL / kuyucuk ve 24 oyuklu plaka için 1 mL / kuyucuk) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamından (DMEM) oluşan hücre kültürü ortamı ekleyin. Kuyu plakasını bir hücre kültürü inkübatörüne (37 ° C,% 5 CO₂) koyun ve 1 saat inkübe edin.
3. Bu arada, tohumlama için hücre kültürü hazırlayın.
   not: Agaroz dökümü başına toplam hücre tohumlama sayısına araştırmacı tarafından karar verilmelidir. Murin primer pankreas kanseri hücre hatları için, sonraki tüm tahliller için 35.000 hücre / 35 mikrokuyu dökümü ve 81.000 hücre / 81 mikrokuyu dökümü (ortalama 1000 hücre / sferoid) tohumlanır. Bir sferoidin ortalama çapı 48 saat sonra yaklaşık 150\u2012200 μm'dir.
4. Önce kuyu plakasını eğerek agaroz dökümünü çevreleyen hücre kültürü ortamını bir P1000 pipeti ile çıkarın. Ardından tohumlama odasındaki ortamı dikkatlice çıkarın.
5. Hazırlanan tümör hücresi süspansiyonunu dikkatlice hücre tohumlama odasına damla damla tohumlayın. Kuyu plakasını dikkatlice hücre kültürü inkübatörüne (37 ° C,% 5 CO₂) 15 dakika boyunca
   not: Bu aşama sırasında, hücreler agaroz dökümünün mikro kuyularına yerleşecektir.
6. Agaroz dökümünün dışına ek ortam ekleyin (12 oyuklu plaka için 2.5 mL/kuyucuk ve 24 oyuklu plaka için 1 mL/oyuk).
7. Kuyu plakasını 48 h.
   için hücre kültürü inkübatörüne (37 ° C,% 5 CO₂) geri koyun not: Genellikle hücrelerin mikro kuyularda sferoidler oluşturması birkaç saat kadar sürer. Genel olarak, katı tümör hücresi sferoidleri 24 saat sonra oluşur ve 48 saat sonra stabildir. Bununla birlikte, bu farklı hücre hatları arasında değişebilir. Gerekirse, agaroz kalıpları ile kuyu plakasını dikkatlice eğerek ve çevreleyen hücre kültürü ortamını bir P1000 pipeti ile çıkararak hücre kültürü ortamını değiştirin. Daha sonra kuyu duvarı boyunca pipetleyerek dikkatlice taze ortam ekleyin. Genellikle, küçük hacmi ve sferoidlerin çıkarılma riski nedeniyle alçı içindeki ortamı değiştirmek gerekli değildir.

2. T hücreleri ile ko-kültür

1. Gerekli sayıda T hücresini, uygun T hücresi kültür ortamının 75 μL'sinde (35 mikrokuyu dökümü) veya 190 μL'sinde (81 mikrokuyu dökümü) yeniden süspanse edin (RPMI, %10 fetal sığır serumu ve 100 birim / mL penisilin / streptomisin).
2. Kuyu plakasını eğerek önce bir P1000 pipeti ile agaroz dökümünü çevreleyen hücre kültürü ortamını çıkarın. Ardından, tohum ekme odasının bir köşesini bir P200 pipeti ile nazikçe hedefleyerek ve diğer elinizle kuyu plakasını eğik tutarak, döküm içindeki ortamı yavaş ve dikkatli bir şekilde çıkarın.
3. (Kritik adım 1) Sferoidlerin çıkarılması riski olduğundan, mikroskop altında 10x büyütmede görüntüleyerek ortamı çıkarmadan önce ve sonra mikro kuyulardaki sferoid sayısını karşılaştırarak sferoid kaybını kontrol edin.
4. P200 pipetini alçının yaklaşık 0,5 cm üzerinde tutarak T hücresi süspansiyonunu agaroz dökümünün tohumlama odasına damla damla dikkatlice tohumlayın.
5. (Kritik adım 2) T hücrelerini eklerken sferoidleri dışarı atma riski vardır. Bu nedenle, T hücrelerini çok yavaş ve tohumlama odasının yaklaşık 0,5 cm yukarısına eklemek çok önemlidir.
   not: Yıkanan sferoidlerin sayısını azaltmanın bir olasılığı, T hücrelerini eklerken pipeti tohumlama odasının bir köşesine doğrultmak, böylece yalnızca bu köşedeki sferoidlerin dışarı atılmasını riske
atmaktır.
6. Kuyucuk plakasını 15 dakika boyunca hücre kültürü inkübatörüne (37 ° C,% 5 CO₂) dikkatlice yerleştirin.
7. Kuyu plakasını inkübatörden çıkarın ve agarozun etrafına taze hücre kültürü ortamı (% 10 fetal sığır serumu ve 100 birim / mL penisilin / streptomisin ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Institute ortamı (RPMI)) ekleyin kuyu duvarı boyunca yavaşça pipetleyerek.
8. Kuyu plakasını 48 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3D Petri Kapları	Mikro Dokular A.Ş	Z764019 & Z764051	protokollerde "kauçuk kalıplar" olarak anılır; 81-mikrokuyu ve 35-mikrokuyu kalıpları
8 Kuyulu Hazneli Kaydıraklar	Lab-Tek	154534
Agaroz Tip I, düşük EEO	Sigma-Aldrich	A6013
DMEM, fetal sığır serumu	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	11965092, 16000044	protokollerde "hücre kültürü ortamı" olarak anılır
DEV/SINIR	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	11875093	T hücresi kültür ortamı için

. Gazetesi Serisi