Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Akupeksiyon Prosedürü
NOT: Optimal DNA miktarı ve hedef cilt yüzeyinin alanı farklı genler için değişebilir ve daha fazla optimize edilmesi gerekir. Derinin azgın tabakasını gevşetmek için iğneleme kuvveti ve sayısı da cilt kalınlığına bağlı olarak değişebilir. Bu koşullar, qRT-PCR ile etkilenen gen transkriptlerinin ekspresyon seviyesi değerlendirildikten sonra dikkatli bir şekilde belirlenmelidir.
- Fareleri tartın ve periton enjeksiyonu ile tribromoetanol (gm vücut ağırlığı başına 400 μg) uygulayın.
NOT: 2,2,2-tribromoetanol, farelerde yaygın olarak kullanılan enjekte edilebilir bir anestezik ajandır. Çözeltiler, farmasötik olmayan bir sınıf 2,2,2-tribromoetanolün (2,5 g)% 2,5 2-metil-2-bütanol içeren damıtılmış suda (200 mL) çözülmesiyle yapılır.
- Anestezi altında kuruluğu önlemek için gözlerde veteriner oftalmolojik merhem kullanın.
not: Anestezik etki 1-2 dakika içinde indüklenecektir. Ameliyattan önce yeterli anestezi derinliğini sağlamak için ayak parmağını sıkıştırma refleksini kontrol edin.
- Sırt yan derisini tıraş edin ve saç telindeki keratin proteinlerini çözmek için tüy dökücü krem uygulayın.
not: Tüyleri almak için tüy dökücü krem kullanılması, DNA'nın cilde infüzyonunu kolaylaştıracaktır.
- Tüy dökücü kremi silmek için suya batırılmış pamuk topları kullanın.
not: Tüy dökücü krem suda çözünür. Kremin tamamen çıkarılması, yağlı bir yüzeyi önleyecek ve daha iyi bir iğneleme sonucu sağlayacaktır.
- Cilt yüzeyini dezenfekte etmek için %70 etanole batırılmış steril bir pamuklu çubuk kullanın.
- Epilasyondan arındırılmış cilt üzerindeki hedef alanı (1 cm x 1 cm) önceden ölçülmüş bir şablonla işaretleyin. not: Hedef bölgeyi işaretlemek, iğne demetinin tanımlanmış bir alan içinde yukarı ve aşağı uygulanmasına yardımcı olacaktır. Bu, deneyden deneye varyasyonu en aza indirmek için aynı miktarda DNA'nın belirli bir yüzey alanına iletilmesini sağlamak için önemlidir.
- İşaretli cilde 10 μL'lik bir damla plazmit DNA (10 μg) yerleştirin.
not: Akupreksiyon için DNA miktarı, farklı genlere ve ekspresyon vektörünün türüne göre değişir. Kullanılan DNA miktarı, ilgilenilen deneyi gerçekleştirmeden önce dikkatlice titre edilmelidir. 10 μL küçük bir sıvı damlasıdır ve traş edilmiş ve tüyleri alınmış cilde iğneleme sırasında aşağı yuvarlanmadan iyi oturur. Çalışma geni ile etkilenen farelerle karşılaştırmak için 10 μL boş vektör DNA ile tedavi edilen bir fare kontrol grubunu dahil edin.
- Akupunktur iğnesi demetini tutun (Şekil 1B) ve işaretli yüzeyi 100 kez yukarı ve aşağı hareketlerle veya ciltteki PBS'deki DNA'dan gelen nem kaybolana kadar delin. not: Cilt yüzeyinde bir miktar kızarıklık oluşabilir. Kanayan derin kesimler yapmaktan kaçının.
Cilt yüzeyindeki yukarı ve aşağı iğneleme hareketlerinin sayısı, PBS'deki (10 μL) DNA'dan gelen nem ciltte kaybolduğunda işlevsel olarak belirlenir. 30 saniyede 100 kez karar verdik çünkü akupreksiyon ile verilen genlerden en tutarlı sonuçları verdi. Mümkünse, iğneler 6 adede kadar hedef cilt deliği (her biri 1 cm x 1 cm) için yeniden kullanılabilir. İğneleri akupeksiyon arasında% 70 etanol ve PBS ile durulayın. Çapraz kontaminasyonu önlemek için donuk olduklarında veya farklı plazmit DNA'ları için yeni iğnelere geçin.
- Uyanana kadar vücut ısısını korumak için etkilenen fareleri bir ısıtma yastığına yerleştirin.
- Yeterli bilinç kazandıklarında fareleri kafeslerine geri koyun. not: Etkilenen fareleri, etkilenmemiş farelerin kafesinden ayrı bir kafeste (kafes başına 5 hayvandan az) tutun.
- Su şişesini yerine yerleştirin ve kafesi IVC (ayrı ayrı havalandırılan kafes) rafına geri koyun.
2. Ameliyat Sonrası Bakım
- İşlemden sonraki ilk 48 saat boyunca, davranış değişiklikleri (huzursuzluk, ajitasyon veya yeme bozukluğu) veya anormal görünüm (kaba tüy veya kambur duruş) dahil olmak üzere herhangi bir rahatsızlık için fareleri yakından izleyin.
