Tümöre Özgü CAR T Hücrelerinin Anti-Tümör Aktivitesini Değerlendirmek için İn Vitro Test

Özet

Kaynak: Kueberuwa, G., et al. CD19 CAR T Hücrelerinin Klinik Öncesi Değerlendirmesi için Sinjenik Fare B Hücreli Lenfoma Modeli. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücresi aktivitesini doğrulamak için bir in vitro testi göstermektedir. CD19 antijeni ve sitoplazmik lusiferaz eksprese eden B hücreli lenfoma hücreleri, CD19'a özgü CAR T hücreleri ile birlikte kültürlenir. Bir tümör üzerinde CD19'a CAR bağlanması, CAR T hücrelerinin tümör hücresi sitotoksisitesine neden olan sitokinleri ve toksinleri serbest bırakmasına neden olur. CAR T hücresi aktivitesi, tümör hücrelerinde salınan sitokin ve azalmış lusiferaz aracılı biyolüminesansın ölçülmesiyle değerlendirilir.

Protokol

1. CAR T hücresi Aktivitesinin In vitro Doğrulaması

1. Tohum sinjeneik hedef CD19 + tümör hücreleri 1 x 10 yoğunlukta lusiferaz ekspresyonu olan veya olmayan^{tümör hücreleri 100} μL tam T hücre ortamında (TCM) / 96 oyuklu U-alt doku kültürü plakasında 4 hücre.
2. 1: 1.
   'lik bir hedef (ET): T) oranı elde etmek için 100 μL / kuyu hacminde 1 x 10⁴ CD19 CAR T hücresi / kuyusu ekleyin not: Her CAR yapısı ve hedef hücre hattı için E: T oranları oluşturulmalıdır.
3. Negatif kontroller olarak tek başına T hücrelerini ve tek başına tümör hücrelerini ve forbol-miristat-asetat (PMA) (50 ng / mL) ve iyonomisin (1 μg / mL) tarafından uyarılan T hücrelerini İnterferon-gama (IFNy) salınımı için pozitif kontrol olarak kullanın. 37 ° C'de ko-kültür hücreleri, 16-24 saat boyunca% 5 CO₂.
4. Ko-kültürü takiben, plakaları 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin ve daha fazla IFNγ ve IL-12p70 ELISA analizi için süpernatanı toplayın.
   not: Bu -80 °C'de saklanabilir.
5. Lusiferin içeren 100 μL PBS'de hücre peletlerini yeniden süspanse edin (nihai konsantrasyon 1.5 mg / mL). Plakaları 37 °C'de 10 dakika inkübe edin. Daha sonra her bir kuyucuktan gelen lüminesansı uygun bir luminometre ile ölçün.
   not: Maruz kalma süreleri, hücre çizgileri ve yoğunluğu için optimize edilmelidir. Temsili sonuçlar Şekil 1a'da gösterilmiştir. CAR T hücrelerinin ex-vivo sitotoksisitesi, hedef antijeni eksprese eden hücre hatları ile ko-kültür yoluyla lusiferini eksprese etmek için modifiye edilebilir. CAR T hücreleri hedef hücreleri öldürürken, lusiferin salınır, bu nedenle luminometri sinyalindeki bir azalma hücre öldürme ile ilişkilidir. Transdüksiyon yapılmamış hücreler, özellikle uzun inkübasyon dönemlerinde, hedef hücre canlılığı üzerinde sıklıkla bir etkiye sahip olabilir. Süpernatanttaki murin IFNγ ve IL-12p70 konsantrasyonunu üreticinin ELISA protokollerine göre ölçün. Temsili sonuçlar şurada gösterilmiştir (Şekil 1b ve 1c). Hedef antijeni eksprese eden hücre hatları ile ko-kültür yoluyla CAR T hücrelerinin ex-vivo aktivasyonu, ELISA kullanılarak süpernatant içeriklerinin analiz edilmesiyle test edilebilir. CAR T hücresinin hedef hücrelere oranı ve ko-kültür periyodunun uzunluğu, her CAR yapısı, hedef hücre hattı ve analit için optimize edilmelidir. PMA ve iyonomisin tedavisi, T hücrelerinin kalitesini ve yanıt verme yeteneklerini doğrulamak için pozitif bir kontrol olarak kullanılabilir.

Sonuçlar

Şekil 1. CAR T hücresi aktivitesinin doğrulanması. αmCD19 CAR T hücreleri, U-tabanlı 96 oyuklu bir plakada 16 saat boyunca lusiferazı (1 x 10⁴: 1 x 10⁴) eksprese etmek üzere modifiye edilmiş A20 lenfoma hücreleri ile birlikte kültürlendi. Ko-kültürden sonra hücreler peletlendi ve süpernatant toplandı. A) Hücreler PBS'de yeniden süspanse edildi ve hedef hücrelerin...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
100X penisilin-streptomisin-glutamin (PSG)	Gibco (Gibco)	10378016
Akış sitometresi - LSR Fortessa x20	BD Biyolojik Bilimler	658222R1
Fetal Sığır Serumu	Gibco (Gibco)	10270
IL-12 p70 Fare Kaplamasız ELISA Kiti	Canlandırıcı	88-7121-76
İyonomisin Kalsiyum Tuzu	Sigma- Aldrich	I0634
Luminometre - Lumistart Omega	BMG Laboratuvar Teknolojisi	415-301
Murin IFN-γ ELISA kiti	Diyaklon	861.050.010
Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)	Sigma- Aldrich	P8139 Serisi
RPMI 1640 Orta	Fransa	BE12-167F
XenoLight D-Luciferin	Perkin Elmer	122799

Serisi