Kanser Hücrelerine Karşı Doğal Öldürücü Hücre Sitotoksisitesini Değerlendirmek için İn Vitro Test

Özet

Kaynak: Baik, C. H., et al. Sıçan Plasental Doğal Öldürücü Hücre Sitolitik Fonksiyonunun Değerlendirilmesi için Plaka Bazlı Bir Sitotoksisite Testi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, hedef kanser hücrelerine karşı doğal öldürücü (NK) hücrelerin sitotoksisitesini belirlemek için bir laktat dehidrojenaz salım testinin gerçekleştirilmesini göstermektedir. Test, oluşan kırmızı renkli ürünün absorbansını ölçerek sitoplazmik laktat dehidrojenaz enziminin kanser hücrelerinden salınmasını ölçer.

Protokol

1. Sitotoksisite Deneyi: Test Protokolü

1. Plakayı Tablo 1'de önerildiği gibi ayarlamak için yuvarlak tabanlı, kültürle muamele edilmiş 96 oyuklu bir plaka kullanın. Bu tabloda, deneysel kontroller ve 3 NK deneysel sütun kümesi gösterilmektedir. Bu, 96 oyuklu bir plakada toplam 10 NK deney sütununa genişletilebilir.
2. Efektör ve hedef hücrelerin temas halinde olduğundan emin olmak için test plakasını 250 x g'da 4 dakika santrifüjleyin. 96 oyuklu plakayı, 37 ° C'de,% 5 CO_2'de nemlendirilmiş bir oda inkübatöründe 5 saat boyunca inkübe edin, böylece hedef ve efektör hücreler arasında geniş temas ve efektör hücreler tarafından hedef hücre lizisi elde edin.
   not: Protokol buradan duraklatılabilir.
3. Süpernatanları hasat etmeden 45 dakika önce, Hedef Hücre Maksimum LDH Serbest Bırakma kuyularına (Kuyu 1E, 1F, 1G ve 1H) 10 μL 10x Lizis Çözeltisi ekleyin ve plakayı nemlendirilmiş odaya geri yerleştirin.
4. İnkübasyon süresi tamamlandıktan sonra, plakayı 4 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin. Çok kanallı bir pipetleyici kullanarak, tüm oyuklardan 50 μL'lik alikotları 96 oyuklu yeni bir 96 oyuklu düz tabanlı tahlil plakasına aktarın.
   not: Hücrelerin taze tahlil plakasına aktarılmaması için kuyucukların dibine dokunmayın. Taze tahlil plakası olarak kültürlenmiş bir işlem görmüş plaka kullanmayın.

2. Tahlil Reaktifi Yapın.

1. Tahlil Tamponu oda sıcaklığına ulaştıktan sonra, bir Substrat Karışımı şişesine 12 mL Tahlil Tamponu ekleyin. Tamamen eriyene kadar ters çevirin ve hafifçe sallayın. İki adet 96 oyuklu plaka için 1 şişe yeterlidir.
   not: Tahlil Tamponu çözülürken ışıktan korunmalıdır. Kullanmadan hemen önce karıştırın.
2. Adım 4.6'dan itibaren tahlil plakasındaki tüm kuyucuklara 50 μL Test Reaktifi ekleyin. Işıktan korumak için plakayı folyo ile örtün ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
   not: Yeni yapılan Test Reaktifi bir dondurucuda saklanmalıdır. Reaktif yaklaşık 8 hafta boyunca iyidir.
3. Her kuyucuğa 50 μL Durdurma Çözeltisi ekleyin. Durdurma Çözeltisini ekledikten sonra 1 saat içinde plakayı okuyun ve absorbansı 490 nm.
   'da kaydedin Temsili veriler Tablo 2'de gösterilmektedir.

Tablo 1: Tahlil Plakası Düzeni. TCS = Hedef hücre Spontan LDH Salınımı (50 μL hedef hücre + 50 μL hedef hücre ortamı); TCM = Hedef Hücre Maksimum LDH Salınımı (50 μL hedef hücre + 50μL hedef hücre ortamı); VCC = Hacim Düzeltme Kontrolü (50 μL hedef hücre ortamı + 50 μL NK Hücre ortamı); CMB = Kültür Ortamı Arka Plan Kontrolü (50 μL hedef hücre ortamı + 50 μL NK Hücre ortamı); ECSR = Efektör Hücre Spontan Salınımı (50 μL NK hücreleri + 50 μL NK hücreleri orta); EW = Deneysel kuyular (50 μL hedef hücreler + 50 μL NK hücreleri).

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi

1	2	3	4	5
Tcs	Sanal kredi kartı	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcs	Sanal kredi kartı	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcs	Sanal kredi kartı	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcs	Sanal kredi kartı	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcm	SPK	EW-1 Serisi	EW-2 Serisi	EW-3 Serisi
Tcm	SPK	EW-1 Serisi	EW-2 Serisi	EW-3 Serisi
Tcm	SPK	EW-1 Serisi	EW-2 Serisi	EW-3 Serisi
Tcm	SPK	EW-1 Serisi	EW-2 Serisi	EW-3 Serisi

Tablo 2: NP ve RUPP sıçanlarından alınan plasental NK hücrelerinin sitotoksisitesini ölçmek için sütun 1 ve 2'deki deneysel kontrolleri ve deneysel kuyuları içeren bir tahlil plakasının ham absorbans verileri.

1	2	3	4	5
		Np	RUPP (RUPP)	Np
0,615	0,484	0,473	0,463	0,471
0,586	0,484	0,458	0,474	0,469
0,61	0,486	0,464	0,459	0,469
0,605	0,55	0,524	0,526	0,543
0,576	0,504	0,519	0,502 0,528	00.528
0,565	0,512	0,515	0,513	0,531
0,563	0,581	0,526	0,508	0,519

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
96 oyuklu Doku Kültürü Plakası	HÜCRE TEDAVİSİ	229190	Steril, Yuvarlak Alt
Hücre kazıyıcı	balıkçı	8100241
Cytotox 96 Radyoaktif Olmayan Sitotoksisite Test Kiti	Promega	G1780
DEV/SINIR	Gibco (Gibco)	11875135	1640 Orta
YAC-1 hücresi	ATCC (Uzay Servisi)	TİB-160

Fuar Serisi Serisi