Moleküllerin gecikmeli bir patlama salınımı için yeni bir dağıtım platformu oluşturma tekniği

Özet

Kaynak: Arun Kumar, S. et al., <a href="https://app.jove.com/v/60569">Yakın Kızılötesine Duyarlı, Çekirdek Kabuklu Aşı Dağıtım Platformu Üretimi.J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, gecikmeli patlama salınımını sağlayan bir polimer kabarcık veya polikabarcık tabanlı yeni bir platform oluşturma yöntemi gösterilmektedir. Polyester bazlı polimerler, çekirdek-kabuk yapısına sahip polikabarcıkları oluşturmak için kullanılır ve küçük moleküller ve antijenler kargo olarak kullanılabilir.

Protokol

1. Polikaprolakton triakrilat (PCLTA) sentezi

1. 3.2 mL 400 Da polikaprolakton (PCL) triolünü 50 °C'de gece boyunca açık 200 mL yuvarlak tabanlı şişede ve potasyum karbonatı (_K2CO3) 90 °C'de bir cam şişede kurutun.
2. Triol'ü argon altında 6.4 mL diklorometan (DCM) ve 4.246 g_K2CO3 ile karıştırın.
3. 2.72 mL akriloyl klorürü 27.2 mL DCM içinde karıştırın ve 5 dakika boyunca şişedeki reaksiyon karışımına damla damla ekleyin.
4. Reaksiyon karışımını alüminyum folyo ile örtün ve argon altında 24 saat oda sıcaklığında rahatsız edilmeden bırakın.
5. 24 saat sonra, fazla reaktifleri atmak için vakum altında bir Buchner hunisi üzerinde bir filtre kağıdı kullanarak reaksiyon karışımını filtreleyin.
6. Dietil eter içinde uç kapaklı polimeri içeren adım 1.5'ten filtratı 1: 3 (hacim / hacim) ve dietil eteri çıkarmak için 30 ° C'de rotavap çökeltin.

2. Çoklu kabarcığın oluşumu

NOT: Deiyonize (DI) suya polimer enjekte etmek, polikabarcıkların şişenin dibine göç etmesine neden olarak düzleşmiş tabana neden olur. Polikabarcık düzleşmesini önlemek için cam şişeyi doldurmak için %10 (ağırlıkça/hacim) karboksimetil selüloz (CMC) kullanın.

1. DI suyunda %10 (ağırlıkça/hacimce) CMC çözeltisi hazırlayın.
2. 0.92 mL'lik bir cam şişeyi 1 mL'lik bir transfer pipeti kullanarak 0.8 mL% 10 CMC ile doldurun.
3. DCM'de 1000 mg / mL 14 kDa PCL'yi karıştırın ve toplam 200 μL hacim için 1: 3 (hacim / hacim) içinde PCLTA'yı sentezleyin veya 200 μL 1000 mg / mL 5 kDa poli (laktik-ko-glikolik asit) diakrilat hazırlayın (PLGADA) kloroformda.
4. 2-hidroksi-4" - (2-hidroksietoksi) -2-metilpropiyofenonu (foto başlatıcı) polimer (PLGADA veya PCL / PCLTA) karışımı ile 0.005: 1 (hacim / hacim) karıştırın.
5. 200 μL polimer karışımını, iç çapı 0,016 inç olan bir dağıtım paslanmaz çelik boruya bağlı bir şırınga pompasına monte edilmiş 1 mL'lik bir cam şırıngaya yükleyin.
6. Polikabarcığı oluşturmak için cam şişedeki %10'luk CMC'ye polimer enjekte etmek için polimer tüpünün ileri ve geri hareketini kontrol etmek için bir mikromotor kullanın.
7. Polikabarcıkları ultraviyole (UV) altında 254 nm dalga boyunda 60 saniye boyunca 2 W/^cm2'de kürleyin.
8. Polikabarcıkları sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve gece boyunca 0.010 mBar vakumda ve -85 °C'de liyofilize edin.
9. Forseps kullanarak polikabarcıkları kurutulmuş CMC'den ayırın ve kalan CMC'yi çıkarmak için polikabarcıkları DI suyla yıkayın. Diğer polimerlerin, salım kinetiğini değiştirmek için muhtemelen modifikasyonlarla kullanılabileceğini unutmayın.

3. Polybubble çapının modülasyonu

1. 1 mL'lik bir transfer pipeti kullanarak 0,92 mL'lik bir cam şişeyi %10 CMC ile doldurun.
2. PCL / PCLTA'yı 1000 mg / mL 14kDa PCL ile 1: 3 (hacim / hacim) içinde karıştırın ve PCLTA'yı sentezleyin. Foto başlatıcıyı 0.005:1 (hacim/hacim) oranında bir polimer karışımı ile karıştırın.
3. Polimer karışımını, iç çapı 0,016 inç olan bir dağıtım paslanmaz çelik boruya bağlı bir şırınga pompasına monte edilmiş 1 mL'lik bir cam şırıngaya yükleyin.
4. Polikabarcığı oluşturmak için cam şişedeki %10'luk CMC'ye polimer enjekte etmek için polimer tüpünün ileri ve geri hareketini kontrol etmek için bir mikromotor kullanın.
5. Çeşitli çaplarda polikabarcıklar elde etmek için, dağıtım hızını 0,0005 ila 1 μL/sn arasında değiştirin.
6. Farklı çaplara sahip polikabarcıklar ile şişenin görüntülerini alın.
7. Çoklu kabarcıkların çapını ölçmek için ImageJ'yi kullanın ve şişenin boyutunu ölçek olarak kullanın.

4. Kargonun polybubble içinde merkezlenmesi

1. K₂CO₃ kullanılarak PCL / PCLTA viskozitesinin modülasyonu:
   not: PLGADA'nın viskozitesinin_K2CO3kullanılarak modifiye edilmesine gerek yoktur, çünkü 1000 mg/mL'de 5 kDa PLAGDA'nın viskozitesi kargoyu merkezlemek için yeterlidir.
   1. 0 mg / mL, 10 mg / mL, 20 mg / mL, 40 mg / mL ve 60 mg / mL dahil olmak üzere değişen konsantrasyonlarda PCLTA'ya_K2CO3 (PCLTA reaksiyonundan sonra izole edilen) ekleyin.
   2. Reometri kullanarak kesme hızını 0'dan 1000 1/s'ye değiştirerek çözeltilerin dinamik viskozitelerini ölçün.
   3. Farklı konsantrasyonlarda K2, CO,₃ (adım 4.1.1) içeren PCL/PCLTA çözeltileri kullanılarak oluşturulan polikabarcıkların ortasına kargoyu manuel olarak enjekte edin (kargo karışımını hazırlamak için adım 4.2'ye bakın). Adım 4.1.1'deki hangi çözeltinin yükün ortada kalmasına neden olabileceğini gözlemleyerek optimum K₂CO₃ konsantrasyonunu belirleyin.
2. Yükün CMC ile merkezlenmesi (küçük moleküllerle fizibilite zaten gösterilmiştir)
   1. Yükün viskozitesini artırmak için kargoyu gece boyunca bir döndürücüde %5 (ağırlık/hacim) CMC ile karıştırın.
   2. Polybubble'a 2 μL kargo karışımını manuel olarak enjekte edin ve 2 W/^cm2'de 60 saniye boyunca 254 nm dalga boyunda UV kürlemeye devam edin.
   3. Polikabarcıkları 30 saniye boyunca sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve gece boyunca 0.010 mBar vakumda ve -85 °C'de liyofilize edin.
   4. Polikabarcıkları forseps kullanarak kurutulmuş CMC'den ayırın ve kalan CMC'yi çıkarmak için DI suyla yıkayın.
   5. Polikabarcığı ikiye bölün ve yükün ortalandığından emin olmak için konfokal mikroskopi kullanarak yarıları görüntüleyin (kullanılan uyarma ve emisyon dalga boyları için adım 6'ya bakın).

5. Kargo Formülasyonu

NOT: Polybubble formülasyonu, küçük moleküller, proteinler ve nükleik asitler dahil olmak üzere çeşitli kargo türlerini barındırabilir.

1. Önceki çalışmalara dayanarak, protein kargosu söz konusu olduğunda, polikabarcık formülasyonu sırasında proteinin stabilitesini iyileştirmek için polietilen glikol (PEG), polivinilpirolidon (PVP) ve glikopolimerler dahil olmak üzere eksipiyanlar kullanın.
2. 2. adımdaki protokole dayalı olarak çoklu kabarcıklar oluşturun.
3. 625 μL HIV gp120/41 antijenine 17.11 g trehaloz ekleyerek antijen çözeltisini hazırlayın.
4. Polikabarcığın ortasına manuel olarak 1 μL antijen çözeltisi enjekte edin.
5. 0, 7, 14 ve 21. günlerde polikabarcıkları açın ve sırasıyla 497 nm ve 520 nm uyarma ve emisyon dalga boyları ile antijenin floresansını kaydedin.
6. Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) kullanarak antijenin işlevselliğini belirleyin ve bloke edici tampon olarak% 5 yağsız süt kullanın.

6. Kargonun serbest bırakılması

NOT: Kargo tipi olarak küçük molekül veya antijen kullanılabilir

1. Küçük molekül
   1. 37 °C'de, PLGADA polikabarcıkları için 50 °C'de ve PCL/PCLTA polikabarcıkları için 37 °C, 50 °C, 70 °C'de 400 μL fosfat tampon salin (PBS) içinde ortalanmış akriflavin ile polikabarcıkları inkübe edin.
      not: Vücut sıcaklıklarının üzerinde test yapılmasını önermemizin nedeni, a) PCL ve PLGA içindeki altın nanoçubukları (AuNR'ler) lazerle lazerlerken polikabarcığın ulaştığı sıcaklığı (50 °C) simüle etmektir; ve b) PCL'nin bozunma sürecini hızlandırır (50 °C, 70 °C).
   2. Her zaman noktasında, süpernatanları toplayın ve 400 μL taze PBS ile değiştirin.
   3. Toplanan süpernatantlardaki floresan yoğunluklarını ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.
      not: Akriflavin için 416 nm/514 nm ex/em kullanın.
2. Antijen
   1. 37 ° C'de 400 μL PBS'de ortalanmış sığır albümin serumu (BSA) -488 ile 37 ° C'de, PLGADA polikabarcıkları için 50 ° C'de ve PCL / PCLTA polikabarcıkları için 37 ° C, 50 ° C'de inkübe edin.
   2. Her zaman noktasında, süpernatanları toplayın ve 400 μL taze PBS ile değiştirin.
   3. Toplanan süpernatantlardaki floresan yoğunluklarını ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın. BSA-497.
      için 488./ nm/em kullanın not: Antijenin aşırı sıcaklığa maruz kalmasını önlemek için PCL/PCLTA polikabarcıkları için 70 °C'de salım çalışması yapılmamalıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 Adımlı Ultra Tetrametilbezidin (TMB)-Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi (ELISA) Substrat Çözeltisi	Termo bilimsel	34028
2-Hidroksi-2-metilpropiyofenon	TCI AMERİKA	H0991
TMB Substrat için 450 nm Durdurma Çözümü	Abcam Belediyesi	AB17152
Akriloil klorür	Sigma Aldrich	A24109-100G
Akriflavin	Chem-Impex Uluslararası	22916
Susuz etil eter	Fisher Kimya	E138-500
Yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge anti-HIV1 gp120 antikoru
Sığır serum albümini (BSA)	Fisher BiyoReaktifleri	BP9700100
BSA-CF488 boya konjugatları	Canlandırıcı	A13100
Karboksimetilselüloz (CMC)	Kırlangıç Sigma	80502-040
kloroform	Fisher Kimya	C2984 Serisi
Kaplama tamponu	Abcam Belediyesi	ab210899
Diklorometan (DCM)	Sigma Aldrich	270997-1L
Dietil eter	Fisher Kimya	E1384
Legato 100 Şırınga Pompası	KD Bilimsel	14 831 212
Yağsız kuru süt	Andwin Bilimsel	NC9022655
Potasyum karbonat	Acros Organik	AC424081000
Fosfat tuzlu su tamponu	Fisher BiyoReaktifleri	BP3991
(Poli (kaprolakton)	Sigma Aldrich	440744-250G
(Poli (kaprolakton) triol	Acros Organik	AC190730250
Poli (laktik-ko-glikolik asit) diakrilat	CMTec (CMTec)	280050
Rekombinant HIV1 gp120 + gp41 proteini	Abcam Belediyesi	AB49054
Trehaloz	Acros Organik	NC9022655

Serisi (İngilizce) · Serisi Serisi (İngilizce) · Serisi Serisi · Serisi