1. Bakteri hücre kültürleri ve Lactobacillus hücresiz süpernatantın (LCFS) hazırlanması
NOT: Adım 1.2 – 1.9, anaerobik bir odada gerçekleştirilir.
- L-sistein içeren bir De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) agar plakası ve et suyu hazırlayın ve otoklavlama ile sterilize edin.
- MRS agar plakasını 37 ° C'de tutulan H2 anaerobik odasında 20 ppm oksijen ile önceden inkübe edin.
- Lactobacillus bakteri stoğunu çözün ve agar plakasını bakteri kültürü ile aşılayın (Şekil 1A (i)).
- Bakterileri H2 anaerobik odasında 37 ° C'de ve 20 ppm oksijende 2 - 3 gün boyunca tek bakteri kolonileri elde edilene kadar inkübe edin.
- Hungate tipi anerobik kültür tüpünü yıkayın ve kurulayın. Kültür tüpünü 121 °C'de 15 dakika otoklavlayın.
- Daha sonra oksijeni çıkarmak için tüpü H2 anaerobik odasında 37 ° C'de ve 20 ppm oksijende inkübe edin.
- Tüpe 2-3 mL MRS suyu yerleştirin. Tüpü bir bütil kauçuk tıpa ile kapatın ve kapağı vidalayın.
- Bir ilmek ile tek bir koloni elde edin ve 500 μL 1x PBS ile 1.5 mL kültür tüpüne yerleştirin. (Şekil 1A (ii)).
- 1 mL'lik bir şırınga kullanarak koloniyi askıya alın (Şekil 1A (iii)). Bunu, 1 mL şırınganın iğnesini tüp kapağının ortasına sokarak, askıya alınan koloniyi aspire ederek ve daha sonra MRS et suyu ortamına geri süspanse ederek yapın. (Şekil 1A (iv)).
- MRS et suyu ortamını 2 gün boyunca bir çalkalayıcı inkübatörde inkübe edin (37 °C,% 5 CO2, 200 rpm).
- OD620'deki absorbans 2.0'a ulaşana kadar bakteri büyüme eğrilerini izlemek için bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluğu (OD) ölçün.
- Bakteri peletlerini ve şartlandırılmış ortamı 1.000 x g'da 15 dakika santrifüjleyerek ayırın. Toplanan bakteri peletlerini 1x PBS ile yıkayın ve %10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş 4 mL RPMI 1640'ta yeniden süspanse edin. Ortama herhangi bir antibiyotik dahil etmeyin.
- Bakteri peletlerini RPM'de tutun ve 100 rpm hızında %5 CO2 ile 37 ° C'de 4 saat boyunca bir çalkalayıcı inkübatörde inkübe edin.
- Probiyotik süpernatantın hazırlanması için, bakteri peletini 1000 x g'da santrifüjleme yoluyla 4 ° C'de 15 dakika boyunca çıkarın. Geri kazanılan süpernatanı 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak steril filtreleyin ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
2. Sferoidlerin nesli
- Kolorektal kanser hücre hatlarının hazırlanması
- DLD-1, HT-29 ve WiDr hücre hatlarını% 70-80 birleşene kadar tek tabakalar olarak büyütün ve plakayı% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin (Büyüme ortamı:% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin içeren RPMI).
- 100 mm'lik Petri kabında büyütülen hücreler için, plakayı 4 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın. 1 mL %0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri ayırmak için Petri kabını %5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de 2 dakika inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, mikroskop altında hücre ayrışmasını kontrol edin ve tripsin-EDTA'yı 5 mL büyüme ortamı ile nötralize edin.
- Ayrışmış hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 300 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve 3 mL büyüme ortamı ile nazikçe yeniden süspanse edin.
- Bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri belirlemek için tripan mavisi ile hücreleri sayın. (Şekil 1B (i))
- Küresel oluşum
- 15 mL'lik konik bir tüpte, 1 - 2 x 105 hücre / mL elde etmek için hücreleri 2.1.5'ten seyreltin (Şekil 1B (ii))
- Hücre süspansiyonuna %0.6 metilselülozun son konsantrasyonunu ekleyin ve seyreltilmiş hücreleri steril bir rezervuara aktarın.
NOT: Her hücre hattı için gereken metilselüloz miktarı titre edilmeli ve buna göre belirlenmelidir.
- Ultra düşük bağlantılı 96 oyuklu yuvarlak tabanlı mikroplakanın her bir oyuğuna 200 μL hücre dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın. (Şekil 1B (iii))
- Plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde 24 - 36 saat inkübe edin.
- 24 - 36 saat sonra, küresel oluşumu sağlamak için plakayı ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
3. 3D kolorektal kanser hücrelerinin LCFS ile tedavi
edilmesi
- Adım 2 ve 3'te açıklandığı gibi sferoidler oluşturun.
- LCFS tedavisini gerçekleştirmeden önce, donmuş LCFS'yi oda sıcaklığında (RT) 10 - 20 dakika çözdürün.
- LCFS stok çözeltisini bir büyüme ortamına aşılayın. Büyüme ortamında seri olarak %25, %12.5 ve %6'ya seyreltin (ör.% 25 LCFS = 150 μL büyüme ortamı + 50 μL LCFS).
- İnkübatörden sferoidler içeren hücre kültürü plakasını çıkarın ve 200 μL'lik bir pipet kullanarak her bir oyuktan mümkün olduğunca fazla büyüme ortamını çıkarın.
- LCFS'li büyüme ortamını hücrelere ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde 24 - 48 h.
için inkübe edin
not: Kullanılacak hacim, aşağıdaki gibi plaka boyutuna bağlı olacaktır: 6 oyuklu hücre kültürü plakaları için 2 mL; 96 oyuklu hücre kültürü plakaları için 200 μL.
