Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Göbek Kordonu Kanının İşlenmesi ve İnsan Hematopoetik Kök/Progenitör Hücrelerinin (HSPC'ler) İzolasyonu
- Protokolün tüm aşamalarını laminer akış kabinlerinde steril koşullar altında gerçekleştiriniz.
- Heparinize tüplerde toplanan göbek kordonu kanını (CB) alın ve fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek hacmi 35 mL'ye kadar çıkarın. Numuneyi, Şekil 1'de gösterildiği gibi lenfosit ayırma ortamının (LSM) üzerine yerleştirin ve LSM'yi katmanlı CB ile katmanlı CB ile 4 ° C'de 35 dakika boyunca frensiz olarak santrifüjleyin.
not: Arayüzde karışmasını önlemek için kanı dikkatlice ve nazikçe seyreltin.
- Üst LSM ve plazma katmanını dikkatlice çıkarın ve beyaz buffy coat arayüzünü bir transfer pipeti kullanarak yeni bir tüpe aktarın.
- Buffy kaplamayı 30 - 40 mL buz gibi soğuk tamponda (PBS +% 0.5 sığır serum albümini [BSA] + 2 mM etilendiamintetraasetik asit [EDTA]) tekrar süspanse edin. Bir pipet kullanarak, 20 μL hücre süspansiyonunu 20 μL% 0.4 tripan mavisi ile birleştirin ve karışımın 10 μL'sini bir sayma slaytının iki odasından birinin dış açıklığına pipetleyin ve hücreleri saymak için slaydı otomatik bir hücre sayacına yerleştirin.
not: Hücrelerin canlı kalmasına yardımcı olduğu için tüm adımlarda buz gibi soğuk tampon kullanın.
- Hücreleri 300 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice aspire edin. Ardından 300 μL buz gibi soğuk tampon ekleyin.
- 1 x 108 hücreye kadar 100 μL insan Fc reseptörü bloke edici reaktif ve 100 μL monoklonal fare anti-insan CD34 antikoru konjuge mikro boncuklar ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin, hücreleri yıkamak için 10 mL buz gibi soğuk tampon ekleyin ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
NOT: 1 x 108'den fazla hücre varsa, bunu hücre numarasına göre ölçeklendirin.
- Süpernatanı dikkatlice çıkarın, peleti 500 μL tamponda yeniden süspanse edin ve HSPC'leri zenginleştirmek için manyetik ayırma adımına devam edin.
- Manyetik olarak etkinleştirilen hücre sıralama alanına pozitif bir seçim LS sütunu (Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin ve 3 mL tampon ile geçirin.
- Numuneyi, numunelerde insan CD34+'a bağlı mikro boncukları yakalayabilen ve yerçekimi etkisi altında toplama tüpüne akmasına izin veren LS kolonuna yükleyin.
- Kolonu 3x tampon ile yıkayın ve elute'yi hücrelerin CD34- fraksiyonunun aynı toplama tüpünde toplayın.
- CD34 + hücrelerini yeni bir toplama tüpüne boşaltmak için kolonu 5 mL tamponla daldırın. %>90'lık bir saflık elde etmek için işlemi tekrarlayın.
- Bir hemositometrede tripan mavisi boya kullanarak ayrıştırılmış CD34 + hücrelerini sayın. Saydıktan sonra, CD34 + hücrelerini 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Transplantasyonda hemen kullanılacak bir enjeksiyon için CD34 + hücrelerini 25 μL PBS'de yeniden süspanse edin veya hücreleri donma ortamında 1-2 milyon / mL'lik bir konsantrasyonda kriyoprezervasyon yapın (Roswell Park Memorial Institute ortamı [RPMI 1640 orta] +% 50 fetal sığır serumu (FBS) +% 10 dimetil sülfoksit [DMSO]) transplantasyonda daha fazla kullanım için.
not: Transplantasyonda kullanmadan önce her zaman canlı hücreleri sayın.
- CD34 + elute'nin saflığını kontrol etmek için, 50 μL süspansiyon alın ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca 10 μL fikoeritrin veya PE konjuge anti-insan CD34 antikoru ile inkübe edin. Antikor inkübasyonundan sonra, lekeli hücreleri PBS ile yıkayın, 100 μL PBS içinde yeniden süspanse edin ve ardından akış sitometrisi yapmaya devam edin. Akış sitometresindeki geçidi tasarlamak için antikor içermeyen ek bir hücre tüpü ekleyin.
- Alımdan sonra, ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) grafiğinde ilgilenilen bölgeyi seçerek verileri analiz edin, ardından FSC alanı ve FSC yüksekliği grafiklerindeki tek hücreler için geçit yapın. PE kanalındaki ve SSC alanı grafiğindeki tek hücreler üzerindeki CD34 pozitif hücreleri kapılayın.
2. İnsan Hepatositlerinin (HEP'ler) Transplantasyon için Hazırlanması
- Dondurularak saklanmış hepatositleri sıvı nitrojenden çıkarın, şişeyi hızlı bir şekilde su banyosuna daldırın ve yaklaşık 90 - 120 saniye çözün.
- Flakon kapağını çıkarın ve çözülmüş hepatositleri ısıtılmış çözdürme ortamının 50 mL konik tüpüne dökün.
- 50 mL'lik tüpü birkaç saniye elle sallayarak hücreleri askıya alın.
not: Tüpü girdap haline getirmeyin.
- Hücreleri oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 100 x g'da peletleyin. Peletlenmiş hücreleri PBS'de %0.1 BSA ile yıkayın ve bunları PBS'de 80 μL/farelik bir son hacimde taze veya çözülmüş HSPC'lerle (oran 10:1) bir araya getirin.
3. İnsan HSPC ve Hepatosit Nakli için Hayvan Kullanımı, Tarama, Genotipleme ve Tedavi
- Hayvan taşıma
- Şiddetli immün yetmezliğin bir sonucu olarak, aseptik koşullar altında TK-NOG farelerini yetiştirin, barındırın ve kullanın.
- Potansiyel olarak patojenik mikroorganizmalarla enfeksiyonu önlemek için her zaman laboratuvar önlüğü, eldiven, galoş ve yüz maskesi kullanın.
- Ameliyat için steril eldivenler ve aletler kullanın ve ameliyat boyunca hayvanları aseptik olarak kullanın.
- Deney için TK-NOG farelerinin seçilmesi
- Dişi TK-NOG farelerini erkek TK-NOG olmayan littermatlarla çiftleştirerek TK-NOG suş kolonisini koruyun ve genotipleme ile transgenik yavruları seçin.
not: Sütten kesme sırasında yenidoğan erkek ve dişi farelerde transgenin varlığını veya yokluğunu belirlemek için genotipleme yapın (bkz. adım 3.3).
- HSV-TK transgen eksprese eden hepatositlerin GCV aracılı tükenmesine karşı yüksek hassasiyetleri nedeniyle transplantasyon için 6-8 haftalık erkekleri seçin.
- Tanımlamayı kolaylaştırmak için sütten kesme veya ameliyat sırasında fareleri kulak küpesine alın. Hayvanların kilosunu ve sağlık durumunu not edin.
- Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak HSV-TK transgeninin varlığı için genotipleme
- Sütten kesme sırasında (genellikle 3-4 haftalıkken) genotipleme yapın. Genotipleme için, steriliteyi korumak ve bir genomik DNA izolasyon kiti kullanarak genomik DNA'yı çıkarmak için laminer akışlı bir biyolojik güvenlik kabininde fare kulağının bir parçasını kesin.
- 1 μL ileri primer 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 μL ters primer 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0.5 μL FAM probu 5'-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3' ekleyerek insan albümin promotörü kontrolü altında HSV-TK transgenini taramak için 20 μL'lik bir reaksiyon karışımında kulaktan ekstrakte edilen genomik DNA'yı amplifiye edin, ve gerçek zamanlı bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) cihazında 10 μL ana karışım.
- Gerçek zamanlı PCR ayarlarını şu şekilde ayarlayın: 30 sn için 60 °C (ön okuma aşaması), 10 dakika için 95 °C (tutma aşaması), 15 saniye boyunca 95 °C'lik 40 döngü ve 1 dakika boyunca 60 °C (PCR aşaması) ve 30 saniye için 60 °C (son okuma aşaması).
not: 22'nin altındaki bir eşik döngüsü (Ct) HSV-TK transgeni için pozitif olarak kabul edilir.
- Gansiklovir ve treosulfan kullanarak tedavi
- 27 G iğne kullanarak, farelerin transgenik parankimal hücrelerini tüketmek için ameliyattan önce 100 μL salin içinde günde 2 kez 7. günde ve 5. günde 2 kez intraperitoneal GCV enjeksiyonları (6 mg / kg) enjekte edin (Şekil 2'deki deneysel stratejide gösterildiği gibi).
- Ameliyattan önceki 3, 2 ve 1. günlerde, fareleri 27 G'lik bir iğne kullanarak 100 μL salin içinde miyeloablatif olmayan intraperitoneal dozlarda treosülfan (1.5 g / kg / gün) ile ön koşullandırın.
- Ameliyattan bir gün önce, submandibular venden 5 mm'lik bir neşter ile delinerek iki ila üç damla (~ 100 μL) kan alın ve serumu santrifüjleyerek (4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.500 x g) izole edin alanin aminotransferaz (ALT) karaciğer hasarının derecesini değerlendirmek için.
- Ameliyat için hazırlık
- Ameliyattan önce farenin kesi bölgesini çevreleyen (periton duvarının solunda) kürkünü tıraş etmek için makas kullanın.
- Bir fare anestezi makinesi kullanarak bir indüksiyon odasında oksijen akışını 1 L / dk'ya ve izofluran akışını% 3 -% 5'e ayarlayın. Anestezi için indüksiyon odasına her seferinde bir fare yerleştirin.
- Steril bir uzatma tüpünün bir ucunu (550 μL süspansiyon tutma kapasitesine sahip; teknik özellikler için Malzeme Tablosuna bakın) 30 G'lik bir iğneye ve diğer ucunu 1 mL'lik bir şırıngaya takın.
- Şırıngayı, havuzlanmış HEP'lerin ve HSPC'lerin süspansiyonu (80 μL/fare) ile doldurun (bkz. bölüm 2), şırıngayı tekrarlayan bir dağıtım pipetinin çentiğine yerleştirin ve dağıtıcıyı her basışta 10 μL dağıtacak şekilde ayarlayın.
- Fareler uyuşturulduktan sonra (genellikle 3-4 dakika sonra), izofluran akışını burun konisine geçirin ve izofluran akış hızını% 2 -% 3'e düşürün.
- Farelerde insan HSPC'lerinin ve hepatositlerin intrasplenik transplantasyonu
- Tüm ameliyat adımlarını steril koşullar altında laminer akış kabininde gerçekleştirin.
- Çalışma yüzeyinin üzerine temiz, steril bir örtü yerleştirin ve bir kesi yapmadan önce her farenin vücudunun sol tarafını %10 povidon-iyot ve ardından %70 izopropil alkol ile ovalayın.
- Göğüs kafesinin alt kenarının yaklaşık 5 mm altından periton boşluğuna girmek için Vanna tipi makasla periton duvarının solundaki cilt, kas ve karın zarında küçük bir kesi (~1 - 1,5 cm uzunluğunda ve 5 mm derinliğinde) yapın.
- Dalağı bulun, kolay erişim için forseps ile ameliyat alanına hafifçe çekin ve 30 G iğneyi dalağın alt kutbuna sokun.
- Dağıtım pipetinin pistonunun kilidini açın ve dalak başına 10-60 μL sınırla bir seferde 80 μL hacim dağıtın. İğneyi yavaşça geri çekin ve bir ligasyon uygulayıcısı kullanarak dalağı bağlama klipsleriyle klipsleyin.
- Steril PBS ile ıslatılmış pamuk uçlu aplikatörlerle dalağı vücut boşluğuna geri itin.
- Karın duvarının kas tabakasını emilebilir bir sütür kesikli sütür paterni (sürekli değil) kullanarak kapatın. Emilemeyen dikişler kullanarak kesintili bir dikiş paterni ile cilt kapanışını gerçekleştirin.
