>1. Tek zincirli Fab antikoru (scFab)-CAR'ların üretilmesi ve doğrulanması.
NOT: CAR'lar tipik olarak 3 kritik alan içerir: bir antijen hedefleme alanı, bir aralayıcı/transmembran alanı ve bir sitoplazmik sinyal alanı. Her bir CAR'ın kesin tasarımı, amaçlanan hedefe bağlıdır ve bu nedenle, retrovirüsün üretilmesiyle ilgili yapının temel özellikleri dışında, bu protokolde ayrıntılı olarak açıklanmayacaktır. Aşağıda açıklanan çalışmalar için kullanılan CAR'ların genel tasarımı Şekil 1'de gösterilmektedir. Kısaca, hedefleme alanı, yarı sert bir bağlayıcı ile bağlanan ana monoklonal antikordan gelen ağır zincirin tüm hafif zincirini ve değişken ve CH1 alanını içerir. Ara parça/transmembran alanı fare CD28'den ve sinyal alanı, fare CD28, CD137 (4-1BB) ve CD247'den (CD3ζ) elementler içeren bir füzyondur. Bu elementler, ekleme örtüşmesi polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) veya uygun bir "gen bloğunun" sentezi gibi standart moleküler biyoloji prosedürleri ile birleştirilir. mAB287 CAR'ın neslinin ayrıntıları Zhang ve ark. cDNA dizileri talep üzerine yazarlardan temin edilebilir.
- CAR yapısının montajı
- Hedefleme tek zincirli Fab antikorunu (scFab) ve birleşik aralayıcı/sinyal alanlarını ayrı ayrı sentezleyin ve son yapıyı birleştirmek için "3 noktalı" bir ligasyon tekniği kullanın (Şekil 1).
NOT: CAR eki için temel gereklilik, retroviral ekspresyon vektörü pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II) veya ilgili bir türevin de uygun olduğu şekilde ligasyona izin veren yan kısıtlama endonükleaz bölgeleri içermesi gerektiğidir.
- CAR yüzey ifadesinin doğrulanması
- Standart bir protokol tarafından üretilen pMIG II'den türetilmiş retroviral partikülleri kullanarak hibridoma hücrelerini dönüştürün (örneğin, Holst ve diğerleri).
- CAR vektöründen GFP ekspresyonunu tespit etmek için akış sitometrisi analizini çalıştırın.
- Fare κ zincirine karşı etiketli antikorlar kullanılarak transdüksiyona uğramış hibridomların CAR'ının yüzey ekspresyonunu lekeleyin (ör., klon RMK-45).
- CAR özgüllüğünün doğrulanması
- Transdüksiyona uğrayan hibridoma hücrelerini uygun plakaya bağlı veya hücresel antijenlerle uyarın. Gece boyunca ko-kültürden sonra süpernatanlar ve salgılanan sitokinler toplanır ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile test edilir.
NOT: İdeal olarak, her CAR, transdüksiyon için kullanılmadan önce bağımsız olarak doğrulanmalıdır. Bu adımda, deneme duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başlatılabilir.
2. Viral üretici hücrelerin transfeksiyonu (gün - 4 ila 3. gün)
NOT: Retrovirüs, Phoenix-ECO hücreleri kullanılarak üretilir (Malzeme Tablosuna bakınız). Potansiyel olarak bulaşıcı ajanların üretilmesi için uygun önlemleri kullanın (tercihen belirlenmiş bir Biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) kabini ve transfekte edilmiş/transdüksiyonlu hücrelerin kültürlenmesi için ayrı bir inkübatör dahil).
- Phoenix hücrelerinin çözülmesi (Gün -4)
- 2 x 106 Phoenix-Eco hücresini çözün. Birden fazla transdüksiyon planlanıyorsa Phoenix hücrelerinin sayısını artırın.
- Bunları 10 mL besiyeri (Dulbecco'nun %10 fetal buzağı serumu (FCS) içeren modifiye Eagle besiyeri (DMEM)) ile 10 cm'lik bir doku kültürü kabına koyun.
- Geçit Phoenix hücreleri (Gün -3)
- Ortamı çıkarın ve 5 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) ile yıkayın.
- 3 mL% 0.25 tripsin ekleyin ve% 10 CO2 atmosferi altında% 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin.
- Hücreleri hasat edin, ardından 200 x g'da 3 dakika santrifüjleme ile pelet haline getirin. Hücreleri 10 mL taze ortam ile yeniden plakalayın ve 37 °C'de inkübe edin.
- Phoenix hücrelerinin ışınlanması (Gün -1 öğleden sonra)
- Daha fazla hücre bölünmesini en aza indirmek için, adım 2.2'de tarif edildiği gibi Phoenix hücrelerini toplayın, 5 mL ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri buz üzerinde (1000 rad) gama ışınlayın.
NOT: Personelin maruz kalmasını önlemek için radyasyon çalışmaları için dikkatli olunmalıdır.
- Işınlanmış hücreleri santrifüjleyin, taze ortamda yeniden süspanse edin, 2 x 106 hücrede (10 mL ortamda) / plaka / CAR'da plaka ve inkübe edin.
- Transfeksiyon (Gün 0 - sabah)
- Süpernatanı Phoenix hücrelerinden aspire edin, 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve tek tabakayı bozmamak için plakanın yan duvarına damla damla 7 mL indirgenmiş serum ortamını (örn., Opti-MEM) dikkatlice ekleyin. Hücreleri inkübatöre geri aktarın.
- İki adet 14 mL yuvarlak tabanlı polipropilen tüp alın ve her birine 1.5 mL indirgenmiş serum ortamı ekleyin. Bir tüpe 40 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Diğer tüpe 15 μg Ab-CAR-plazmit (adım 1'de oluşturulur) ve 5 μg zarf ve ambalaj plazmidi (5 μg pCL-Eco) ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- Adım 2.4.2'deki transfeksiyon reaktif karışımını, tüp kenarlarına temas etmeden ikinci tüpe damla damla ekleyin ve çözeltiyi 3 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Oda sıcaklığında en az 20 dakika inkübe edin.
- Phoenix hücrelerine damla damla 3 mL karışım ekleyin ve bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.
- 4-5 saat sonra 1 mL FCS ekleyin. Hücreleri gece boyunca 37 °C'de kültürleyin.
- Orta değişim (1. Gün)
- Plazmid/transfeksiyon reaktif komplekslerini içeren süpernatanı çıkarın ve bunları enfeksiyöz materyalin işlenmesi için kurumsal prosedürlere uygun olarak atın. Hücrelere 4 mL taze, önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin.
- Transdüksiyon için virüs hasadı (2. Gün)
- Virüs içeren ortamı Phoenix hücrelerinden steril bir şırınga ile toplayın, artık hücre kalıntılarını gidermek için filtreleyin (0.45 μm) ve yeni bir tüpte toplayın.
- Rekombinant insan interlökin-2 (rhIL-2) stokunu 200 uluslararası birim (IU) / mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. İletim için virüsü hemen kullanın (adım 5.3). Phoenix hücrelerine 4 mL taze besiyeri ekleyin ve inkübatöre yerleştirin.
- Virüs toplama işlemini tekrarlayın (3. gün)
- Adım 2.6'yı tekrarlayın, ancak Phoenix hücrelerini taze ortam eklemek yerine bulaşıcı atık olarak atın. Bu süpernatant adım 5.4'te kullanılır.
>3. Birincil CD8 T hücresi izolasyonu ve aktivasyonu (gün -1 ila gün 0)
NOT: Önceden, adacık iltihabı başlamadan önceki bir zaman noktası olan 4-5 haftada, dişi obez olmayan diyabetik (NOD) farelerden CD8 T hücreleri toplayın. Tüm fareleri Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) onaylı protokolleri takip ederek kullanın. CD8 T hücreleri, ticari bir negatif seçim kiti kullanılarak splenositlerden zenginleştirilir.
- CD3/CD28 antikorları ile kaplama plakaları (Gün -1)
- 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 mL anti-fare CD3 ve CD28 antikorları karışımı (her ikisi de PBS'de 1 μg / mL'de) ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, murin CD8 T hücrelerini eklemeden önce plakaları 1 mL steril PBS ile 3 kez yıkayın (adım 4.1).
NOT: Kaplanacak kuyucuk sayısı, gereken toplam aktive edilmiş CD8 T hücresi sayısına bağlı olarak her deney için değişecektir.
- Splenositlerin toplanması (Gün 0)
- CO2 inhalasyonu ve ardından dekapitasyon kullanarak 4-5 haftalık iki NOD dişi fareye ötenazi yapın. Dalakları hasat edin ve buz üzerinde bir hücre kültürü kabında 10 mL PBS'ye batırılmış bir hücre süzgecine koyun.
- Bir hücre kültürü davlumbazında, her dalağı 3-5 parçaya bölün, dalak parçalarını ayırmaya zorlamak ve hücrelerin tel örgüden geçmesine izin vermek için dokuları 3 veya 5 mL'lik bir şırınganın steril bir pistonu ile bastırın.
- Splenositleri 1: 4 seyreltilmiş kırmızı hücre lizis tamponunda (bir dalak için 3 mL PBS'de 1 mL lizis tamponu) yeniden süspanse ederek ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe ederek kırmızı kan hücrelerini nazikçe çıkarın.
- Daha sonra, bir hemositometre ile hücreleri saymak için 10 μL hücre süspansiyonunu tripan mavisi boya çözeltisi ile seyreltin ve hücrelerin geri kalanını 7 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleme ile peletleyin.
- CD8 T hücrelerinin zenginleşmesi (Gün 0)
- Üreticinin talimatlarını izleyerek bir fare CD8 T hücre izolasyon kiti kullanarak CD8 T hücrelerini negatif seçimle zenginleştirin.
NOT: Yüksek saflığı sağlamak için, eklenecek biyotinile antikor hacmini hesaplarken her zaman hücre sayılarını yuvarlayın (örneğin, hesaplanan 9.1 x10 7 hücre için 10 8 hücre için önerilen reaktif hacmini kullanın).
- Hücre peletlerini 1 x 108 hücre başına 400 μL tampon ve 100 μL biyotin-antikor kokteyli içinde askıya alın, iyice karıştırın ve antikor bağlanmasını sağlamak için buzdolabında (4 ° C) 5 dakika inkübe edin.
- 1 x 108 hücre başına 300 μL etiketleme tamponu ve 200 μL anti-biyotin mikro boncuk ekleyin, iyice karıştırın ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
- Mikro boncuk bağlamasını beklerken, ayırma sütununu ayırıcıya yerleştirin. Sütunu 3 mL etiketleme tamponu ile durulayarak yıkayın.
- Hücre agregalarını çıkarmak için ayırma kolonuna yüklemeden önce 1000 μL boncuk/hücre karışımını 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Kolon akışını önceden soğutulmuş 15 mL'lik bir tüpe toplayın.
- Kolonu üreticinin talimatına göre yıkayın ve tüm atık suları aynı tüpte toplayın. Hücre numarasını belirleyin (adım 3.2.4 ile aynı) ve 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleme ile toplayın. 2 mL tam T hücre ortamında (FCS, 2-merkaptoetanol, rhIL-2 (200 U / mL) içeren RPMI-1640, fare İnterlökin-7 (mIL-7, 0.5 ng / mL), ITS, 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) ve penisilin-streptomisin) ve 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyerek hücreleri yıkayın.
- Hücreleri önceden ısıtılmış (37 ° C) tam T hücresi ortamında 0.25-0.5 x 106 / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin.
4. T hücresi aktivasyonu (Gün 0 ila 2)
- Adım 3.1.2'den itibaren CD3 / CD28 antikor kaplı 24 oyuklu plakanın her bir kaplanmış kuyucuğuna 2 mL hücre süspansiyonu (0.25-0.5 x 106 / mL) ekleyin. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için dönen bir hareket kullanın.
NOT: Hücreleri eşit şekilde dağıtmak ve kenar etkilerini en aza indirmek için döndürme hareketi kullanarak ekleyin. Hücreler kuyucukların kenarı boyunca kümelenirse, hem iletim hızı hem de hücre canlılığı azalacaktır.
- Bir kontrol olarak, aynı sayıda CD8 T hücresini, plakanın kaplanmamış tek bir kuyucuğuna yerleştirin. Hücreleri 37 ° C'de% 10 CO2 gazlı inkübatör kullanarak 48 h.
için inkübe edin
NOT: 48 saat sonra, aktivasyon bir mikroskop kullanılarak doğrulanabilir; aktive edilmiş hücreler, anti-CD3 / CD28 antikorları ile karşılaşmayan hücrelerden daha büyük olacaktır.
5. Aktive edilmiş CD8 T hücrelerinin transdüksiyonu (1-3. günler)
NOT: Bu protokol bir spin-transdüksiyon yöntemi kullanır. 37 °C'lik bir iç sıcaklığı koruyabilen, açılır rotorlu bir santrifüj ve doku kültürü plakası adaptörleri gereklidir. Maksimum verimliliği sağlamak için, iletim gününde virüsü toplamadan önce santrifüjü 37 °C'ye ısıtın.
- İnsan fibronektin fragmanı kaplı plakaların hazırlanması (1. gün - 2. gün)
- 1. günde, 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına 0.5 mL fibronektin (PBS'de 50 μg / mL) ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
NOT: Tipik olarak, transfekte edilmiş Phoenix hücrelerinin plakası başına iki fibronektin kaplı kuyucuk gereklidir.
- 2. günde fibronektin çözeltisini çıkarın ve PBS'de 1 mL% 2 sığır serum albümini (BSA) ile değiştirin. Spesifik olmayan bağlanma bölgelerini "bloke etmek" için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- İşlem görmüş kuyucukları 1 mL steril PBS ile yıkayın. Yıkama solüsyonunu çıkardıktan sonra, plaka kullanıma hazırdır; veya kapatılabilir ve 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
- Aktive edilmiş CD8 T hücrelerinin toplanması (2. Gün)
- Aktive edilmiş CD8 T hücrelerini hasat edin, tripan mavisi veya uygun bir otomatik cihaz kullanarak hücre canlılığını sayın ve hesaplayın.
- Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve transdüksiyon için 5 x 106 canlı hücre / mL'de yeniden süspanse edin. Transdüksiyona uğrayan hücrelerin müteakip floresan ile aktive edilmiş hücre sıralaması için bir kontrol sağlamak üzere CO2 inkübatöründeki tam T hücresi ortamında kültürde küçük bir hücre alikotunu koruyun (adım 6).
NOT: 48 saat boyunca aktivasyondan sonra, toplam hücre sayısı yaklaşık 1,5 kat artmış olmalı ve% 95'ten daha büyük bir canlılığa sahip olmalıdır.
- Transdüksiyon (2. Gün)
- Fibronektin kaplı plakaya oyuk başına (0.5 x 106 hücre) 100 μL aktive edilmiş CD8 hücre süspansiyonu ekleyin. Daha sonra her bir oyuğa 1.5-2 mL virüs içeren ortam (adım 2.6'dan itibaren) ekleyin. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için dönen bir hareket kullanarak karıştırın (Şekil 2).
- Plakayı kilitli bir plastik torbaya koyun ve kapatın (ikincil muhafaza sağlamak için). 37 ° C'de 90 dakika boyunca 2000 x g'da santrifüjleyin.
- Plakayı santrifüjden çıkarın. Biyolojik güvenlikte, kabin plastik torbayı dikkatlice çıkarın ve plakanın dışının herhangi bir ortamla kirlenmediğinden emin olun.
- Ardından plakayı özel 37 °C CO2 inkübatöre aktarın. 4 saat sonra, her bir oyuktan 1 mL ortamı çıkarın ve 1 mL önceden ısıtılmış tam T hücresi ortamı ile değiştirin. CO2 inkübatördeki plakayı değiştirin.
NOT: Aktarılan hücrelerden gelen tüm ortamları bulaşıcı atık olarak kullanın.
