>1. Zebra balığı embriyolarının bakteri ve faj kokteyli ile mikroenjeksiyonu
NOT: Sistemik bir enfeksiyon gerçekleştirmek için embriyonun genellikle 26 hpf'den sonra başlayan kan dolaşımına sahip olması gerekir.
- 26 hpf'den sonra, pronaz tozunun E3 ortamında 2 mg / mL konsantrasyonda çözülmesiyle hazırlanan pronaz çözeltisi ile embriyoları dekoriyonat. Koryonu kırmak için embriyoları nazikçe pipetleyin. Pronaz/E3 ortamını atın ve tüm pronazı çıkarmak için kabı birkaç kez taze E3 ile durulayın.
- Enjeksiyonlardan yaklaşık 5 dakika önce Trikain içeren E3 ortamında zebra balığı embriyolarını uyuşturun.
- Anestezi uygulanmış embriyoları 1. adımda hazırlanan parçaya pipetleyin. Embriyoları yanal pozisyonda hizalamak için ince bir jel yükleme ucu kullanın.
- Yaklaşık 5 μL P. aeruginosa preparatı içeren bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin.
- İğneyi, yumurta sarısı kesesi üzerine yayılmaya başladığı Cuvier kanalının başlangıç noktasına dorsal olarak yerleştirin. 1-3 nL'lik bir hacim enjekte edin ve hacmin doğrudan kanal içinde genişlediğinden ve dolaşıma girdiğinden emin olun.
- Yaklaşık olarak her 50 enjekte edilen embriyodan sonra, enjeksiyon hacminin aynı kalıp kalmadığını kontrol etmek için 100 μL steril PBS ile 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne bir damla bakteri enjekte edin. CFU'yu değerlendirmek için inokulumu LB agar üzerine (bakınız Tablo 1) gece boyunca 37 ° C'de plakalayın.
- Mikroenjekte edilen embriyoları taze E3 besiyeri + PTU (Tablo 1) içeren iki temiz Petri kabına aktarın ve 28 ° C'de inkübe edin.
- Seçilen iki zaman noktasında: Bakteri enjeksiyonundan 30 dakika veya 3 saat sonra, bakteri enjekte edilen embriyoların bulunduğu Petri kaplarından birini inkübatörden çıkarın ve bunları faj kokteyli enjeksiyonu için 6.3'te tarif edildiği gibi rayda hizalayın.
- İnce bir jel yükleme ucu ile yaklaşık 5 μL faj kokteyli (PAO1 suşunu enfekte eden dört faj karışımı) içeren bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin ve mikroenjektöre sabitleyin.
- Faj kokteylini, daha önce bakteri enjekte edilen embriyoların Cuvier kanalına enjekte edin.
- Mikroenjekte edilen embriyoları taze E3 besiyeri + PTU içeren iki temiz Petri kabına aktarın ve 28 ° C'de inkübe edin.
Tablo 1: Çözeltilerin hazırlanması
olur
olur
olur
olur
| Çözümleri | hazırlık |
| Anestezik stok solüsyonu 25X | Damıtılmış H2O içinde 4 mg / mL Trikain. |
| Anestezik çalışma solüsyonu 1X | damıtılmış H2O'nun 1X konsantrasyonuna (0.16 mg / mL) Trikaine ulaşmak için Trikain stok çözeltisi 25X hazırlığını damıtılmış H2O içinde seyreltin. |
| CsCl d=1.3 | 50 mL TN içinde 20.49 g |
| CsCl d=1.4 | 50 mL TN içinde 20.28 g |
| CsCl d=1.5 | 50 mL TN içinde 34.13 g |
| CsCl d=1.6 | 50 mL TN'de 41.2 g |
| Zebra balığı embriyosu için E3 embriyo ortamı | 1 L 1of E3 (50X stoğunu damıtılmış H2O ile seyreltin) + 200 μl %0.05 metil mavisi. RT'de saklayın. |
| E3 embriyo orta stok çözeltisi (50X) | 5 L damıtılmış H2O'da 73.0 g NaCl, 3.15 g KCl, 9.15 g CaCl2 ve 9.95 g MgSO4. RT'de saklayın. |
| LB agar | 10 g/L tripton, 5 g/L maya özütü, 5 g/L NaCl, 10 g/L agar |
| LB suyu | 1L için: 950 mL H2O, 10 g Tripton, 10 g NaCl, 5 g Maya özü |
| PBST (Yüksek Lisans) | PBS 1X + Triton X %1 |
| Fizyolojik çözüm | % 0.9 NaCl |
| Pigmentasyon engelleme stok çözeltisi 10X | Zebra balığı embriyosu için E3 embriyo ortamında 0.3 mg / mL fenil tiyoüre (PTU) tozu |
| Pronase stok çözeltisi 5X | Zebra balığı embriyosu için E3 embriyo ortamında 5 mg / mL pronaz tozu |
| TN tamponu | 10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl |
