Bir Sıçanın Kesitli Aşil Tendonu İçine Trombositten Zengin Plazma Enjeksiyonu

Özet

Kaynak: Greimers, L., et al. Allojenik Trombositten Zengin Plazmanın (PRP) Sıçanların Kesitli Aşil Tendonlarının İyileşme Süreci Üzerindeki Etkileri: Metodolojik Bir Açıklama. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, sıçanların kesitli Aşil tendonuna trombositten zengin plazma (PRP) enjekte etmek için bir tekniği göstermektedir. Bir alıcı sıçanın Aşil tendonundan küçük bir segment eksize edilir, bölge dikilir ve sıçanın iyileşmesine izin verilir. Aynı zamanda, bir donör sıçandan tam kan toplanır ve PRP elde etmek için santrifüjlenir, daha sonra aktive edilir ve tendon onarımını indüklemek için alıcı sıçanın dikişli bölgesine enjekte edilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hayvan Hazırlama

1. 320-450 g ağırlığında 132 adet 2 aylık erkek Sprague-Dawley sıçan kullanın (deney için 120 sıçan ve kan örneklemesi için 12 sıçan, Şekil 1). Her grup için on beş sıçan, 0.8'lik bir kuvvet için yeterliydi (belirtilen etki varsa% 80 istatistiksel anlamlılık bulma şansı).
2. Tüm fareleri, soyunma istasyonu ile donatılmış geleneksel bir tesiste izolasyon koşulları altında klasik kafeslerde barındırın. SPF (spesifik patojen içermeyen) sıçanların özel olarak satın alındığı bir IVC (bireysel olarak havalandırılan kafes) rafında üremeyi başlatın.
3. Aşağıdaki muhafaza koşullarını kullanın: 19-24 °C sıcaklık aralığı; bağıl nem:% 40-60; havalandırma: hava yenileme sıklığı: saatte 10-15; aydınlık/karanlık döngüsü: 12 saat-12 saat.
4. Tüm kafes ekipmanlarını sterilize edin ve ışınlanmış yataklar kullanın. Kafeslerin içine steril karton tepsiler ve havlular yerleştirerek kafes zenginleştirmesini sistemik olarak uygulayın.
5. Kısıtlı koşullar altında bölgeye erişime izin verin: girişte yeni laboratuvar önlüğü, maske, eldiven, ayakkabı ve saç bonesi.
6. Felasa'nın konvansiyonel tesisler için tavsiyelerine göre, her yıl kirli yataklarda barındırılan nöbetçi hayvanlar üzerinde koloni sağlığı izlemesi yapın. Uygun ışınlanmış diyetle kafes başına dört ila beş hayvan tutun ve asitlendirilmiş su ad libitum sağlayın. Günlük olarak izleyin.
7. Cerrahi müdahale için seçilen sıçanları, ameliyattan 2 saat önce üst kafeslerin filtrelenmesiyle ameliyathanelere transfer edin.

2. Cerrahi İşlem

1. Cerrahi aletleri hazırlayın: ince makas, bir kelepçe, iki hemostatik kelepçe ve bir iğne tutucu. Tüm prosedürler sırasında eldiven, maske, başlık ve laboratuvar önlüğü giyin.
2. Sıçanları rastgele iki gruba ayırın (PRP ve salin solüsyonu).
3. Fareyi kafesinden çıkarın ve tartın. Fareleri tanımlamak için numaralı kulak küpeleri kullanın. Gözlerin kurumasını önlemek için korneaya su damlaları yerleştirin.
4. Sıçanı intraperitoneal olarak ksilazin (10 mg / kg vücut ağırlığı) ve ketamin (80 mg / kg vücut ağırlığı) ile uyuşturun. Anesteziyi doğrulamak ve göz reflekslerini kontrol etmek için hayvanları kardiyo-solunum monitörü altına alın.
5. Ağrı kesici olarak boyun bölgesine deri altına 50 μL buprenorfin enjekte edin (her 8-12 saatte bir 0.01-0.05 mg / kg).
6. Sol arka bacak elektrikli tıraş makinesi ile tıraş edin, 3 alternatif izo-betadin/alkol (seyreltilmiş 1:10) solüsyonu ile dezenfekte edin ve fareyi diseksiyon mikroskobu altında ılık bir ped (20 °C) üzerine yerleştirin. Fareyi, ameliyat edilecek bacak üstün bir pozisyonda olacak şekilde lateral dekübit üzerine yerleştirin. Pençeyi cerrahi forseps ile tutun.
7. Makas kullanarak, sol Aşil tendonunu çevreleyen deride küçük bir lateral kesi (20-25 mm) yapın ve Aşil tendon kompleksini ortaya çıkarmak için fasyayı ince makas kullanarak inceleyin (Şekil 2a).
8. Plantaris tendonunu makasla çıkarın (Şekil 2b).
9. Aşil tendonunu kalkaneal girişine 5 mm proksimalde enine kesin ve makas kullanarak 5 mm uzunluğunda bir kısmı çıkarın. Tendonu dikmeyin (Şekil 2c, 2d).
10. Fasyayı ve cildi emilebilir iplikle dikin, overjet sütür (sürekli sütür) yapın. Monofilament sütürler ayrıca deriden cerrahi kesiye çekilmeyi de önleyebilir.
11. Fareyi uyanana kadar bir ısıtma lambasının altına yerleştirin ve ardından fareyi bir kafese (58 x 38 cm) geri koyun (Not: İmmobilizasyon uygulanmaz).

3. PRP Hazırlama

1. Donör sıçanları intraperitoneal enjeksiyon ile ksilazin (10 mg / kg vücut ağırlığı) ve ketamin (80 mg / kg vücut ağırlığı) ile uyuşturun. PRP enjeksiyonu ameliyattan 2 saat sonra herhangi bir anestezi olmadan gerçekleştirilir.
2. Ağrı kesici olarak deri altına 50 μL buprenorfin enjekte edin.
3. Kardiyak ponksiyon ile tam kanı (sıçan başına 20 mL, son kanama)% 3.2 tamponlu sodyum sitrat (0.109 M, antikoagülan) içeren steril tüplere toplayın. Daha sonra, fareyi intrakardiyak enjeksiyonla ötenazi yapın.
4. PRP elde etmek için kanı 150 x g ve oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj edin. Bu ilk düşük hızlı santrifüjleme aşaması iki farklı faz verir: toplam hacmin yaklaşık% 80-90'ını oluşturan kırmızı kan hücrelerinden (RBC'ler) oluşan bir alt faz ve trombositten zengin plazmadan (PRP) oluşan bir üst faz (tipik olarak kan örneğinin% 10-20'si).
5. PRP'yi (üst faz) plastik bir transfer pipeti kullanarak ikincil bir plastik tüpte toplayın. PRP ve kırmızı kan hücreleri arasındaki arayüz çok gevşek olduğundan, arayüze çok yakın pipetlemeyin. Düzgün bir şekilde kullanıldığında, PRP'deki kirletici RBC'ler 0.05 x 10³ hücre / μL'nin altında olmalıdır. Kalan alt fazı ve birincil kan alma tüpünü atın.
6. Toplanan PRP'nin hacmini belirleyin ve bir hematoloji analizöründe trombosit sayısını ölçün. Bu değerler, bir sonraki adımda trombosit konsantrasyonunu ayarlamak için yapılan hesaplamalar için gereklidir. Kan hücresi sayımı, RBC'ler ve WBC'ler ile potansiyel kontaminasyonu değerlendirmek için de yararlıdır. Bu aşamada PRP'deki trombosit konsantrasyonu tipik olarak 1 – 1.5 x10⁶/μL'dir.
7. PRP'nin 1.000 x g ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ikinci bir santrifüj işlemini gerçekleştirin. Bu yüksek hızlı santrifüjleme adımı, gevşek bir trombosit peleti ve otolog trombositten fakir plazmanın (PPP) bir süpernatantını verir. Adım 3.6'da belirlenen değerleri kullanarak, PRP'yi konsantre etmek ve 2,5 x10⁶/μL'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için atılacak süpernatan hacmini hesaplayın.
8. Süpernatanı (PPP) plastik bir transfer pipeti kullanarak ikincil bir plastik tüpte nazikçe toplayın ve adım 3.7'de hesaplanan nihai hacmin yaklaşık üçte ikisini bırakın. Pelet gevşek olduğundan, PPP atıldığında önemli miktarda trombosit kaybolur ve bu da potansiyel olarak istenen konsantrasyonu azaltır.
9. Nazikçe tekrarlanan pipetleme ile trombosit peletini kalan süpernatan ile dikkatlice yeniden süspanse edin. Bu konsantre PRP'de trombosit sayısını ölçün. Gerekirse, nihai hedef konsantrasyona ulaşmak için uygun hacimde otolog PPP ekleyin.
   not: PRP'yi hazırlandıktan sonraki 3 saat içinde kullanın.
10. Trombositleri aktive etmek için her mL PRP için 50 μL CaCl₂ (11 mEq 10 mL) ekleyin.
11. Hazırlandıktan yaklaşık 1 saat sonra 50 μL taze PRP veya 21G iğne ile salin solüsyonunu doğrudan dikişli operasyon bölgesine enjekte edin. Bu süre zarfında PRP'yi oda sıcaklığında tutun.
12. Ameliyattan sonraki günlerde ve Aşil tendonunun çıkarılmasından önce sıçanların fonksiyonel iyileşmesini yakından izleyin.

Sonuçlar

Şekil 1: Çalışmanın deneysel tasarımı.

Şekil 2: Cerrahi prosedür.

(a) Çevreleyen fasyanın çıkarılmasından sonra tendon kompleksi.

>(b) Plantaris tendonunun çıkarılması.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ksilazin (Ksil-M)	VMD (Sanal Makine)	hiç kimse	Anestezi
Ketamin (Jétamine 1000 CEVA)	CEVA Santé Animale	hiç kimse	Anestezi
Buprenorfin (Veterjésic Multidosis)	ALSTOE (ALSTOE)	hiç kimse	ağrı kesen
izo-Betadin	MEDA-İlaç	hiç kimse	Dezenfekte edici
Emilebilir iplik Vicryl 6/0	Johnson & Johnson
Nembutal	CEVA Santé Animale	hiç kimse	Anestezi
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	P6148 Serisi	Dokunun yapısını korur
İzopropanol %100	VWR (VWR)	2,09,22,364
Etanol %95	VWR (VWR)	2,08,23,362
Ksilen	VWR (VWR)	28973.363
Parafin	VWR (VWR)	LEIC3950.1006
Hematoksilen	Kırlangıç	1.15938.0025	Renklendirici
Eozin	Kırlangıç	1.15935.0100	Renklendirici
Eukitt Belediyesi	Sigma-Aldrich	3989	Montaj Ortamı
CaCl2

Gazetesi Gazetesi adet