$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Uç oligopeptitler (OM-pBAE) ile poli(beta amino esterler) (pBAE) polimerin sentezi
- C6-pBAE'nin polimerizasyonu
- 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103.16 Da) 1-heksilamin (38 mmol; MW = 101.19 Da) yuvarlak tabanlı bir cam şişeye (100 mL) yerleştirin. Daha sonra 1,4-bütandiol diakrilat (82 mmol; MW = 198.22 da).
- Silikon yağ banyosunu 90 °C'de önceden ısıtın, yuvarlak tabanlı şişeyi yağ banyosuna yerleştirin ve karışımı gece boyunca (~ 18 saat) manyetik bir karıştırma çubuğu yardımıyla karıştırın. Daha sonra ürünü yuvarlak tabanlı mataradan alın ve -20 °C'de dondurucuya koyun.
not: Ürün yapışkan bir toz formundadır ve bir spatula yardımı ile mataradan çıkarılır. Elde edilen polimerin yapısını 1H-NMR ile doğrulamak esastır. NMR spektrumları, çözücü olarak kloroform-d ve D2O kullanılarak 400 MHz'lik bir cihazda (Malzeme Tablosuna bakınız) kaydedildi. Her bir poli (β-amino ester) yaklaşık 10 mg alındı ve 1 mL döteryumlu çözücü içinde çözüldü.
- OM-pBAE elde etmek için peptitlerle reaksiyon
- Seçilen peptitlere, örneğin Trifloroasetik asitli (TFA, 200 mg) peptit Cys-His-His-His'e 25 mL 0.1 M HCl ekleyin, daha önce tartılmış 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne, dondurarak kurutmaya dayanabilir ve berrak bir çözelti elde etmek için gece boyunca manuel olarak karıştırın.
- Çözeltiyi -80 °C'de 1 saat dondurun ve elde edilen peptit hidroklorürü dondurarak kurutun.
NOT: Nihai ağırlığın teorik değere karşılık gelip gelmediğini kontrol edin.
- Dimetil sülfoksit içinde bir C6-pBAE (0.031 mmol) çözeltisi yapın. Ayrıca, dimetil sülfoksit içinde bir peptit hidroklorür (0.078 mmol) çözeltisi yapın.
- İki çözeltiyi vidalı kapaklı bir tüpte karıştırın ve kapağı vidalayın. Karışım çözeltisini, manyetik bir karıştırma çubuğu ile 20 saat boyunca 25 ° C kontrollü bir sıcaklığa sahip bir su banyosunda karıştırın.
- Karışımı 7:3 (h/h) dietil eter/asetona ekleyin. Çözücüyü çıkarmak için elde edilen süspansiyonu 4 ° C'de 25.000 x g'da santrifüjleyin. Ardından, katıyı iki kez 7: 3 (v / h) dietil eter / aseton ile yıkayın. Ardından ürünü bir vakum altında (<0,2 atm) kurutun.
- Dimetil sülfoksit içinde 100 mg / mL üründen oluşan bir çözelti hazırlayın. Elde edilen ürün C6-peptid-pBAE olarak adlandırılır. Terminal akrilatlarla ilişkili olefin sinyallerinin kaybolduğunu doğrulamak için elde edilen polimerin yapısını 1H-NMR ile doğrulamak esastır. Kullanılmadığı takdirde polimer -20 °C'de dondurulabilir.
2. Poliplex oluşumu
>NOT: Sabit bir sıcaklığı korumak için tüm prosedürler şartlandırılmış bir odada yapılmalıdır.
- C6-peptid-pBAE polimerlerini çözün ve çözeltiyi girdaplayın.
- Polimer karışımını yukarı ve aşağı pipetleyin ve sodyum asetat (NaAc) içinde 12,5 mM (V1) 'lik bir çözelti hazırlayın. Daha sonra karışımı vorteksleyin ve 10 dakika kadar bekleyin.
- Haberci ribonükleik asidi (mRNA) 0,5 mg/mL'de hazırlayın ve pipetleme (V2) ile karıştırın.
not: mRNA'nın girdaplanmasını önlemek çok önemlidir.
- Dimetil sülfoksit (DMSO) içindeki polimer stoğu ile asetat tamponu arasında homojen bir çözelti elde etmek için polimer karışımını son konsantrasyonda vorteksleyin.
not: Nihai polimer konsantrasyonu, seçilen N/P (nitrojen / fosfat grupları) oranına bağlıdır. N/P oranı, kullanılacak her bir spesifik mRNA'ya bağlıdır. Örneğin, gelişmiş yeşil floresan protein (eGFP) kapsüllemesi için, daha önce bildirildiği gibi 25:1 oranı kullanılmıştır.
- Genetik materyal çözeltisini ve C6-peptidepBAE çözeltisini (mRNA konsantrasyonunun 25 katı) 1:1 oranında (Vi = V1 + V2) karıştırın.
not: C6-peptid-pBAE, mRNA'nın karıştırma için yukarı ve aşağı pipetlenerek eklendiği bir mikrosantrifüj tüpüne yüklenir. Hazırlandıktan sonra, poliplex, nükleik asit ve C6-peptid-pBAE konsantrasyonları yarı yarıya seyreltilir.
- Termal bir blokta 25 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Numuneyi su ile önceden yüklenmiş bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyerek 1: 2 RNaz içermeyen su ile çökeltin.
- Yardımcı maddeleri dahil edin. 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) 20 mM içinde mRNA ve pBAE (Vi) karışımı ile aynı hacmi ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek %4 sükroz ekleyin. Bu noktada, numune 3 kat seyreltilmiştir.
>3. Polipleks liyofilizasyon
- Anında, önceki poliplex solüsyonun -80 °C dondurucusunda 1 saat dondurun.
- Aşağıdaki adımları izleyerek birincil kurutmayı gerçekleştirin: (1) -60 °C ve 0,001 hPa'da 1 saat; (2) -40 °C ve 0,0001 hPa'da 1 saat; (3) -20 °C ve 0,0001 hPa'da 4 saat; (4) 5 ° C'de ve 0.0001 hPa'da 12 saat.
- Kullanana kadar rehidrasyonu önlemek için hemen -20 °C'de saklayın.