1. E. coli BL21(DE3)'te altı sarmal demeti (SHB-SAPN) Proteini içeren Kendiliğinden Birleşen Protein nanopartikülleri çekirdeğinin ifadesi
- Ortamın 95 mL A bileşenini ve 5 mL B bileşenini üreticinin talimatlarına göre 2 L'lik steril bir cam Erlenmeyer şişesinde karıştırın (Malzeme Tablosuna bakın). 100 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona ampisilin ekleyin.
- Ortamı önceden kurulmuş bir gliserol stok kültüründen E. coli ile aşılayın. Kültürü 30 ° C'de, dakikada 200 dönüşte (rpm) 48 h.
çalkalayarak inkübe edin
NOT: Kullanılan E. coli BL21 (DE3) stoğu, SHB-SAPN geni ile ampisiline dirençli ekspresyon vektörünü içeriyordu. Ortamın genel protokolü 37 ° C'de 24 saat inkübasyon önermesine rağmen, 30 ° C'de 48 saat inkübasyon SHB-SAPN için daha yüksek verim sağlar.
- Kültürü iki adet 50 mL'lik konik tüpe aktarın. Tüpleri 4,000 ° C'de sabit açılı bir rotor ile 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti hücreleri hasat etmek için saklayın.
NOT: Hücre peleti hemen işlenebilir veya kullanıma kadar -80 °C'de dondurulabilir.
>2. Sonikasyon ile E. coli BL21 (DE3) lizisi
NOT: 250 °C'de en az 30 dakika fırınlanmış pirojenik olmayan plastik kaplar ve cam eşyalar kullanın. İndirgeyici bir ajan olarak Tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP), proteinlerin içindeki ve arasındaki disülfür bağlarını kırar. Görüntülenen antijen S-S bağları içeriyorsa, bu protokol sırasında tamponlar için TCEP gereklidir. Yalnızca SHB-SAPN çekirdeği için, arabelleklerde TCEP'nin varlığı gerekli değildir.
- İmidazol içermeyen tampon (8 M Üre, 50 mM sodyum fosfat monobazik, 20 mM Tris baz, 5 mM TCEP) pH 8.0 (5 N sodyum hidroksit, NaOH ile ayarlanır) hazırlayın ve 0.22 μm vakum şişesi filtrasyon ünitesi kullanarak filtreleyin.
- Peletlenmiş hücreleri (adım 1.3'ten itibaren) 50 mL'lik bir konik tüpte 40 mL imidazol içermeyen tampon ile yeniden süspanse edin. 150 W'lık bir sonikasyon çıkışı ile 5 dakika (4 s sonikasyon, 6 s dinlenme) boyunca buz üzerinde bir prob ile yeniden askıya alınan hücreleri sonikleştirin.
- Arıtılmış süpernatan oluşturmak için hücresel lizatı (40 mL) 29.000 x g'da 4 ° C'de 25 dakika boyunca sabit açılı bir rotorda santrifüjleyin. Süpernatanı 150 mL'lik steril bir şişeye aktarın ve peleti atın. İmidazol içermeyen tamponu kullanarak süpernatanı 100 mL'ye seyreltin (daha sonra protokolde "numune" olarak anılacaktır).
NOT: Bu seyreltme adımı, kolon üzerindeki lizat yüklemesi sırasında hızlı performanslı sıvı kromatografisi (FPLC) sistem basıncının çok yükselmesini önlemek için gereklidir.
3. His sütunu kullanarak protein saflaştırması
NOT: Bu protokol bir FPLC cihazı kullanılarak gerçekleştirilmiştir, ancak yerçekimi akışına uyarlanabilir.
- Aşağıdaki tamponları hazırlayın ve bunları 0,22 μm vakumlu şişe filtrasyon ünitesi kullanarak filtreleyin: (i) imidazol içermeyen tampon "Tampon A" (8 M Üre, 50 mM sodyum fosfat monobazik, 20 mM Tris bazı, 5 mM TCEP) pH 8.0; (ii) 500 mM imidazol tamponu "Tampon B" (8 M Üre, 50 mM sodyum fosfat monobazik, 20 mM Tris baz, 5 mM TCEP, 500 mM İmidazol) pH 8.0; ve (iii) izopropanol yıkama (20 mM Tris, %60 izopropanol) pH 8.0.
NOT: Her tampon için pH 5 N NaOH ile ayarlanmıştır.
- His-column.
değerini dengeleyin
NOT: Laboratuvar ölçeğinde üretim için, bu protokol 5 mL'lik önceden paketlenmiş bir His sütunu kullanır, ancak daha büyük boyutlu herhangi bir sütun kullanılabilir.
- FPLC yazılımını açın ve Yeni yöntem seçeneğine tıklayın. Hemen Yöntem ayarları menüsüne açılacaktır. Sütun konumu için açılır menünün altında C1 bağlantı noktası 3'ü seçin.
- Tekniğe göre gösterilen açılır menüsünde benzeşimi'ni seçin. Sütun türü açılır menüsünde diğerlerini seçin, Histrap HP, 5 mL. Kolon hacmi ve basınç kutuları otomatik olarak uygun değerlere ayarlanacaktır.
- Yöntem taslağı düğmesine tıklayın. Faz kitaplığı açılır menüsünden şu düğmeleri sürükleyin: dengeleme, örnek uygulama, sütun yıkama ve okun yanındaki elüsyon tam olarak bu sırada. Faz kitaplığı menüsünü kapatın.
- Dengeleme düğmesine tıklayın. Tabloda listelenen değerler "ilk tampon B" (%4), "son tampon B" (%4) ve "hacim (CV)" 5 olmalıdır.
- Örnek uygulama kutusuna tıklayın. Numune yükleme kutusunda, numune pompası ile kolona numune enjekte et radyo düğmesine tıklayın. Sistem pompası ile numune enjeksiyonu kutusunda Yöntem ayarlarından akış hızını kullan seçeneğinin yanındaki kutunun işaretli olduğundan emin olun. Ekranın sağ tarafındaki ses kutusunun yanındaki değeri 20 mL olarak değiştirin.
- Sütun yıkama düğmesine tıklayın. Tabloda listelenen değerler "ilk tampon B" (%4), "son tampon B" (%4) ve "hacim (CV)" 5 olmalıdır. Kesir toplama şemasının yanındaki Etkinleştir kutusunun işaretini kaldırın.
- Elüsyon düğmesine tıklayın. Tabloda listelenen değerler "ilk arabellek B" %0, "son arabellek B" %100 ve "hacim (CV)" 5 olmalıdır. Kesir toplama şemasının yanındaki Etkinleştir kutusuna tıklayın. Yöntem ayarlarından Kesir boyutunu kullan seçeneğinin işaretini kaldırın ve aşağıdaki doldurma kutusunda kesir boyutunu 4 mL olarak ayarlayın.
- Yazılımın üst kısmındaki farklı kaydet düğmesine tıklayın. Dosyayı "dengeleme" olarak adlandırın.
- 5 mL'lik önceden paketlenmiş bir His-sütununu FPLC'deki ilgili sütun bağlantı noktasına 3 bağlayın. Hem pompa A hem de pompa B hortumu ile numune pompası hortumu, 0,22 μm filtrelenmiş deiyonize suya yerleştirilmelidir. Dengeleme programını çalıştırın.
- Hem pompa A'yı hem de pompa B'yi ve ayrıca numune pompası hortumunu imidazol içermeyen tampona (Tampon A) yerleştirin ve dengeleme protokolünü tekrar çalıştırın.
- Numuneyi kolona bağlayın ve proteini saflaştırın.
- FPLC yazılımını açın ve Yeni yöntem seçeneğine tıklayın. Hemen Yöntem ayarları menüsüne açılacaktır. Sütun için açılır menüyü bulun, konum C1 bağlantı noktası 3'ü seçin. Tekniğe göre gösterilen açılır menüsünde benzeşimi'ni seçin. Sütun tipi açılır menüsünde diğerlerini seçin, Histrap HP, 5 mL. Kolon hacmi ve basınç kutuları otomatik olarak uygun değerlere ayarlanacaktır.
- Yöntem taslağı düğmesine tıklayın. Faz kitaplığı açılır menüsünden düğmeleri sürükleyin: dengeleme, örnek uygulama, sütun yıkama (Yıkama 1), sütun yıkama (Yıkama 2), sütun yıkama (Yıkama 3) ve okun yanındaki Elüsyon tam olarak bu sırada. Faz kitaplığı menüsünü kapatın.
- Dengeleme düğmesine tıklayın. Tabloda listelenen değerler "ilk tampon B" %4, "son tampon B" %4 ve "hacim (CV)" 5 olmalıdır.
- Örnek uygulama kutusuna tıklayın. Numune yükleme kutusunda,numune pompasının bulunduğu sütundaki I nject sample için radyo düğmesine tıklayın. Sistem pompası ile numune enjeksiyonu kutusunda Yöntem ayarlarından akış hızını kullan seçeneğinin yanındaki kutunun işaretli olduğundan emin olun.
- Ekranın sağ tarafındaki ses kutusunun yanındaki değeri 100 mL olarak değiştirin. Kesir toplama şemasının yanındaki Etkinleştir düğmesine tıklayın. Yöntem ayarları kutusundan Kesir boyutunu kullan seçeneğinin işaretini kaldırın ve ardından kesir boyutunu 4 mL olarak değiştirin.
- İlk sütun yıkama düğmesine tıklayın (Yıkama 1). Tabloda listelenen değerler "ilk arabellek B" %4, "son arabellek B" %4 ve "hacim (CV)" 10 olmalıdır. Kesir toplama şemasının yanındaki Etkinleştir kutusunu tıklayın. Yöntem ayarlarından Kesir boyutunu kullan seçeneğinin işaretini kaldırın ve ardından kesir boyutunu 4 mL olarak değiştirin.
- İkinci sütun yıkama düğmesine tıklayın (Yıkama 2). Tabloda listelenen değerler "ilk arabellek B" %0, "son arabellek B" %0 ve "hacim (CV)" 5 olmalıdır. Kesir toplama şemasının yanındaki Etkinleştir kutusunu tıklayın. Yöntem ayarlarından Kesir boyutunu kullan seçeneğinin işaretini kaldırın ve ardından kesir boyutunu 4 mL olarak değiştirin.
- Üçüncü sütun yıkama düğmesine tıklayın (Yıkama 3). Tabloda listelenen değerler "ilk arabellek B" %0, "son arabellek B" %0 ve "hacim (CV)" 5 olmalıdır. Kesir toplama şemasının yanında, Etkinleştir'i tıklayın. Yöntem ayarları kutusundan Kesir boyutunu kullan seçeneğinin işaretini kaldırın ve ardından kesir boyutunu 4 mL olarak değiştirin.
- Elution düğmesine tıklayın. Sağdaki tabloda, listelenen bilgilere tıklayın ve gelen menüde Sil adımına tıklayın. İki giriş olması için izokratik gradyan düğmesini tabloya iki kez sürükleyin.
- İlk girişin değeri "ilk arabellek B" %30, "son arabellek B" %30 ve "Hacim (CV)" 10 şeklinde olmalıdır. İkinci girişin değeri "ilk arabellek B" %100, "son arabellek B" %100 ve "hacim (CV)" 10 şeklinde olmalıdır. Kesir toplama şemasının yanındaki Etkinleştir düğmesine tıklayın. Yöntem ayarlarından kesir boyutunu kullan seçeneğinin yanındaki kutuyu tıklayın.
- Yazılımın üst kısmındaki Kaydet düğmesine tıklayın. Dosyayı "arıtma" olarak adlandırın. FPLC'nin Pompa A hortumu imidazol içermeyen yıkama tamponuna, pompa B hortumu ise 500 mM imidazol tamponuna yerleştirilmelidir. Numune pompası hortumu 100 mL'lik numuneye yerleştirilmelidir.
- "Saflaştırma" programını çalıştırın ve% 60 izopropanolün gerekli olduğu zamanı bekleyin (Yıkama 2). Programı duraklatın; pompa A hortumunu imidazol içermeyen yıkamadan %60 izopropanol yıkamaya taşıyın. Programı yeniden başlatın.
- İzopropanol adımı tamamlandığında, programı tekrar duraklatın ve A borusunu imidazol içermeyen yıkama tamponuna geri pompalamak için hareket edin. Arıtma programını yeniden başlatın (çalıştırmanın geri kalanı otomatiktir).
