HIV'e Karşı Tasarlanmış Bağışıklığa Sahip İnsanlaştırılmış Bir Fare Modeli Oluşturma

Özet

Kaynak: Zhen, A., et al. İnsanlaştırılmış Fare Modelinde HIV Enfeksiyonuna Karşı Kök Hücre Tabanlı Tasarlanmış Bağışıklık. J. Vis. Uzm. (2016).

Video, insan immün yetmezlik virüsüne (HIV) karşı kök hücre tabanlı tasarlanmış bağışıklığa sahip insanlaştırılmış bir fare modeli oluşturma tekniğini göstermektedir. İnsan fetal timus dokusu ve tasarlanmış hematopoietik kök hücreler (HSC'ler), bağışıklığı ciddi şekilde baskılanmış bir farenin böbrek kapsülüne implante edilir. HIV'e karşı kimerik antijen reseptörlerini (CAR'lar) eksprese eden HSC'ler, timus dokusu ile birlikte lokalizasyonlarını destekleyen jelatinimsi bir protein karışımı içinde karıştırılır. Prosedür sonrası, HSC'ler çeşitli insan bağışıklık hücrelerine farklılaşır ve bu da HIV'e karşı işlevsel bir insan bağışıklık sistemine sahip insanlaştırılmış bir fare modelinin geliştirilmesine neden olur.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. CD4 Kimerik Antijen Reseptörü ile Tasarlanmış İnsanlaştırılmış Farelerin Yapımı

1. Fetal Timusun İşlenmesi ve Fetal Karaciğerden CD34+ HSC'lerin İzole Edilmesi
   1. Timus İşleme
      1. Timusu 15 ml'lik konik bir tüpte pH 7.4, Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde nazikçe yıkayın. Yıkama adımını 3 - 4 kez tekrarlayın.
      2. 7 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamı +% 10 fetal sığır serumu (FBS) + penisilin / streptomisin (Kalem / strep) ekleyin. Her şeyi 100 mm'lik steril bir Petri kabına boşaltın.
      3. Timusu yaklaşık 1 mm2'lik küçük parçalar halinde kesmek için neşter kullanın. Her bir timus parçasını 96 oyuklu bir plaka üzerinde tek bir kuyuya yerleştirin. Timus parçalarını 96 oyuklu plakaya aktarırken kavisli künt forseps kullanın.
         1. Dokunun kurumaması için tüm kuyucuklara az miktarda ortam (100 - 200 μl) ekleyin. Mikroskop altında görselleştirin (kekiklerin lobları vardır ve hücre çuvalları gibi görünmelidir).
            not: Herhangi bir şekilde şüpheli görünen tüm parçaları atın; Genellikle bağ dokusu vardır ve bu implante edilmemelidir.
      4. Onaylanmış timus parçalarını çıkarın ve hepsini bir T25 hücre kültürü şişesine yerleştirin. % 10 FBS ve 450 μg / ml piperasilin / tazobaktam ve amfoterisin B ile desteklenmiş 7 ml RPMI ortamı ekleyin. Şişeyi gece boyunca 37 ºC /% 5 CO₂.
         'da kültürleyin not: Bu adım, dokunun bakteriyel kontaminasyonunu önlemek için gereklidir.
      5. (İsteğe bağlı adım) Timusu ileride kullanmak üzere dondurun. Parçaları %90 İnsan AB Serumunda %10 Dimetil sülfoksit (DMSO) ile 10 dakika dengeleyin. 1 ºC/dk ila -50 ºC arasında dondurun, ardından -150 ºC'ye hızlı soğutun. Çözülmeye hazır olduğunuzda, 37 ºC'lik bir su banyosunda hızla çözdürün ve DMSO olmadan RPMI tam ortamda 3x'i nazikçe yıkayın.
   2. Karaciğer İşleme
      1. Karaciğeri PBS'de 50 ml'lik konik bir tüpte nazikçe yıkayın. Yıkama adımını 3 - 4 kez tekrarlayın.
      2. 50 ml'lik konik tüpe 10 ml Iscove'un Modifiye Dulbecco's Media'sını (IMDM) ekleyin. Her şeyi 100 mm'lik steril bir Petri kabına boşaltın.
      3. İki neşter kullanarak karaciğer dokusunu homojenize edin. Karaciğeri yaklaşık 3 mm'lik küçük parçalar halinde kesin². Herhangi bir beyaz bağ dokusunu kesin ve atın.
      4. Karaciğer parçalarını ve ortamını almak için 16 gauge künt iğne ile donatılmış 10 ml'lik bir şırınga kullanın. Daha sonra 50 ml'lik konik bir tüpe aktarın.
      5. Besiyerini ve doku süspansiyonunu yeniden süspanse edin ve dokuyu tamamen homojenize etmek için 5-7 kez daha dışarı atın.
      6. Enzimlerle desteklenmiş 10 ml IMDM ortamı hazırlayın: 500 U / ml kollajenaz, 2.400 U / ml hyaluronidaz ve 300 U / ml DNaz'ın yanı sıra 450 μg / ml piperasilin / tazobaktam ve amfoterisin B. Ortamı 0.22 μm'lik bir filtreden süzün, ardından ortamı karaciğer süspansiyonuna ekleyin.
      7. Karaciğer süspansiyonunu içeren 50 ml'lik konik tüpü kapatın ve sızıntıları önlemek için Parafilm gibi kendinden sızdırmaz bir filmle sıkıca kapatın. İnkübatörde 37 ºC'de 90 dakika boyunca bir tüp döndürücüde döndürün.
      8. Sindirilmiş hücre süspansiyonunu 100 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek 50 ml'lik taze bir tüpe süzün.
         not: Toplam hacmi 50 ml'ye çıkarmak için süspansiyona PBS ekleyin. Bunu, her biri 25 ml hücre süspansiyonu içeren iki adet 50 ml'lik tüpe bölün.
      9. Her tüpteki hücreleri 10 ml yoğunluklu santrifüj ortamı (örneğin, Ficoll) ile yavaşça ve nazikçe yerleştirin. Frensiz 20 dakika boyunca 1.200 x g'da döndürün. Not: Bu protokolde belirtilen tüm santrifüjleme işlemleri oda sıcaklığında (25 ºC) yapılır.
      10. Arayüzü (yani buffy coat) her tüpten dikkatlice çıkarın ve iki ayrı 50 ml'lik tüpe aktarın. PBS ile her bir arayüz tüpünün hacmini 50 ml'ye getirin. 300 x g'da 7-10 dakika döndürün. Süpernatanı dikkatlice aspire edin.
      11. İki peleti birleştirin. % 2 FBS içeren 50 ml PBS ile üç kez daha yıkayın. Süpernatanı dikkatlice aspire ederken her biri 7-10 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
      12. Peleti 50 ml RPMI ortamında +% 10 FBS'de yeniden süspanse edin. Hücre sıralamasına geçmeden önce bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
      13. Üreticinin protokolüne göre, bir CD34 sıralama Kiti (örneğin, CD34 mikro boncuklar) kullanarak CD34+ hücrelerini hemen sıralayın.
          not: Alternatif olarak, hücreler gece boyunca RPMI ortamında +% 10 FBS'de 1 milyon / ml'de kültürlenebilir.
      14. Hem CD34+ hem de CD34- kesirlerini kaydedin.
          not: Bu adımda, CD34+ ve CD34- hücreleri, Bambanker dondurma ortamı veya diğer dondurma ortamı kullanılarak dondurulabilir. Tüp başına 1 ml 4 - 6 x 10⁶ CD34 + hücresini dondurun ve tüp başına 1 ml 40 - 60 x 10⁶ CD34- hücresini dondurun.
2. CD34+ Hücrelerinin Transdüksiyonu
   1. 6 oyuklu bir doku kültürü plakası için gereken transdüksiyon kuyularının sayısını hesaplayın. Bir kuyucuk, 8 x 10⁶ hücreye kadar dönüştürmek için kullanılabilir. Her Kemik İliği / Karaciğer / Timus (BLT) faresi için, 0.5 x 10⁶ CD34 + hücreleri, CD34- hücreleri ve timus ile birlikte böbrek kapsülünün altına implante edilecek ve 0.5 x 10^{6 CD34} + hücreleri intravenöz olarak enjekte edilecektir. Kullanılacak CD34+ hücre sayısı fare sayısına göre belirlenir (fare başına 1 milyon hücre).
   2. İhtiyaç duyulan sayıda doku kültürü ile muamele edilmemiş 6 oyuklu plaka kuyucuğunu 1.25 ml rekombinant insan fibronektin çözeltisi (ör., Retronektin) (PBS'de 20 μg / ml) ile her bir oyuğa kaplayın. Plakanın kapağını kapatın ve temiz bir biyogüvenlik kabininde oda sıcaklığında 2 saat bekletin.
   3. Kuyucuklardan fibronektin çözeltisini aspire edin ve bloke etmek için her bir oyuğa 1.25 ml floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tamponu (% 4 FBS'li PBS) ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında (25 ºC) 30 dakika bekletin.
   4. ASPUR FACS: PBS ile kuyuları bir kez tamponlayın ve yıkayın.
   5. Plaka kullanıma hazır olana kadar PBS'yi kaplanmış kuyucuklarda tutun. Hemen kullanılmayacaksa plakayı gece boyunca 4 ºC'de saklayın.
   6. Enfeksiyon Ortamında CD34 + hücrelerini (Yssel'in Serumsuz T-Hücre Ortamında% 2 İnsan Serum Albümini) fibronektin çözeltisi kaplı kuyucuklarda (~ 2 x 10⁶ hücre / ml) plakalayın ve 37 ºC'de 1 saat inkübe edin.
   7. 2 - 10 arasında bir enfeksiyon çokluğunda (MOI) kuyucuklara lentiviral vektörler eklemek için bir pipet kullanın. Yavaşça karıştırın ve gece boyunca 37 ºC.
      'de inkübe edin not: Kullanılan lentivirüs vektörünün titresi önceden belirlenmelidir.
   8. Ertesi gün, kuyuların diplerini bir hücre kazıyıcı ile nazikçe kazıyarak hücreleri hasat edin. Hücreleri toplayın ve bir hemositometre ile sayın.
   9. İmplant için hücreleri hazırlamak için, 0.5 x 10⁶ dönüştürülmüş CD34 + hücrelerini, fare başına 4.5 x 10⁶ CD34- hücreleriyle birleştirin, alikot steril 1.5 ml vidalı kapaklı tüplere dönüştürün. Hücreleri 300 x g'da pelete döndürün ve süpernatanı aspire edin. Bunları tekrar 300 x g'da döndürün, kalan süpernatanı bir P10 pipeti kullanarak aspire edin ve çok dikkatli bir şekilde aspire edin. Kuru peletleri çalışma boyunca buz üzerinde tutun. not: Hücrelerin canlı olduğundan emin olmak için peletlenmiş hücreleri kullanın ve ameliyatı 2-3 saat içinde gerçekleştirin.
   10. Hücreleri enjeksiyona hazırlamak için, süpernatanı peletlemek ve aspire etmek için fare başına 0.5 x^{10 6} dönüştürülmüş CD34 + hücresini döndürün. Fare başına 100 μl RPMI ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın ve buz üzerinde tutun.
   11. Transdüksiyon verimliliğini kontrol etmek için, her koşuldan ~ 1 x 10⁵ dönüştürülmemiş ve dönüştürülmüş CD34 + hücresi ve kültür, 200 μl sitokin ortamında (% 10 FBS'li RPMI ortamı, 100 ng / ml insan IL-3, IL-6, SCF ile desteklenmiş) 96 oyuklu plakada 37 ºC'de 5 - 7 gün boyunca 37 ºC.
       not: Bu adımda kullanılan hücreler ameliyat için kullanılmaz, ancak transdüksiyonun başarılı olmasını ve vektörün kök hücre sağkalımı ve yenilenmesi için toksik olmamasını sağlamak için kullanılır. Transdüksiyon verimliliği, vektörün gen ekspresyonu (örneğin, GFP ve CD4) aranarak kontrol edilebilir ve akış sitometrisi ile analiz edilebilir.
3. Genetik Olarak Tasarlanmış Fareler Oluşturmak için Doku Nakilleri
   1. Ameliyattan önceki aynı gün, NOD'un tüm vücut ışınlaması yapılır. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) Sezyum-137 Işınlayıcı ve 2.7 Gy (270Rad) dozu olan bağışıklığı baskılanmış fareler.
      not: NSG fareleri ciddi şekilde bağışıklık sistemi baskılanmıştır. Bu nedenle, barınmaları ve bakımları en yüksek sağlık standartlarına uygun olmalı ve yüksek eğitimli personel tarafından ele alınmalıdır.
   2. Şişeden timus parçalarını ve ortasını 60 mm'lik bir tabağa dökün. PBS'yi, trokarı temizlemek ve böbreği ıslak tutmak için kullanılacak olan 60 mm'lik başka bir tabağa dökün.
   3. Pozitif yer değiştirmeli pipet uçlarını buz üzerinde açık 1,5 ml steril vidalı kapaklı tüplere yerleştirerek soğutun. Kurutulmuş hücre peletleri ve Matrigel.
      not: Jelatinli protein karışımını ve ona değecek tüm tüpleri veya uçları implant iğnesi yüklenene kadar soğuk tutmak önemlidir.
   4. Fareleri uyuşturun: Fareleri ayrı ayrı tartın ve ağırlıkları kaydedin; fareleri numaralandırmak için kulaklarına yumruk atın. Vücut ağırlığının gramı başına 15 μl Ketamin (salin içinde 2.6 mg / ml) / Xylazine (salin içinde 100 mg / ml) ile intraperitoneal olarak enjekte edin. Fareleri tekrar kafese koyun ve tamamen uyuşturulmalarını bekleyin.
      not: Bir pençe sıkarak farenin anestezi seviyesini kontrol edin. Fare refleks olarak irkilirse, fareyi daha fazla uyuşturmak için orijinal Ketamin / Ksilazin miktarının %25-50'sini uygulayın. Ameliyatı gerçekleştirmek için refleks olarak titremeyene kadar bekleyin.
   5. Oster makası (tıraş makinesi) kullanarak, her farenin sol tarafını kalçadan omuza kadar sırtın ortası ile mide arasında tıraş edin. Deri altından 0.3 ml seyreltilmiş Carprofen (6 mg / kg) hayvanın omzuna veya kasık üçgenine (bacak çukuru) enjekte edin. Pamuklu çubuk kullanarak, her göze küçük bir damla Suni Gözyaşı damlatın ve fareyi kafese yan yatırın.
      not: Ameliyat hazırlığını bir seferde bir kafesle (yaklaşık 4-5 fare) sınırlayın.
   6. 16 gauge kanser implantı iğnesinin (trokar) kanülünü PBS ile yıkayın. Bir çift künt kavisli forseps kullanarak, 60 mm'lik çanaktan bir parça timüs, trokar açıklığın hemen içinde olacak şekilde kanülün açıklığına yerleştirin, ardından dokuyu kanüle aspire etmek için trokarı geri çekin.
   7. 5 μl soğuk, jelatinimsi protein karışımını kurutulmuş hücre peleti (implante edilmiş hücreler için CD34+ ve CD34- karışımı) ile tüpe koymak için pozitif yer değiştirmeli bir pipet ve soğutulmuş bir uç kullanın ve hücre süspansiyonu oluşturmak için hafifçe karıştırın. Yukarı ve aşağı pipetlemeyin. Jelatinli protein karışımını / hücre süspansiyonunu kanülün açıklığına pipetleyin ve iğneyi yüklemek için trokarı yavaşça geri çekin.
      not: İmplant iğnesini manipüle ederken pipeti yüklemek için bir yardımcının olması önerilir.
   8. Farenin traşlı bölgesini Povidon-iyot ile temizleyin ve ardından alanı üç kez alkollü mendille silin. Derinin altındaki en koyu noktayı belirleyin. Bu, dalağın yerini gösterir. Böbrek, dalağın yaklaşık 5 mm dorsalidir. Kavisli forseps ile cildi kaldırın ve dalağa paralel ciltte cerrahi makasla 15 mm uzunluğunda bir kesi yapın. Ardından, aşağıdaki periton tabakasında benzer bir kesim yapın. Erkeklerde, böbrek kolayca görülebilir olmalıdır ve sadece karın üzerine bastırılarak ekstrüde edilebilir. Böbreği kanama durdurucu veya kavisli künt forseps ile destekleyebilirsiniz. Kadınlarda, yumurtalıklar böbreğin kolay çıkarılmasını engelleme eğilimindedir. Bir hemostat kullanarak, yumurtalığı alın ve böbreği dikkatlice açığa çıkarın.
   9. Böbrek kapsülünün arka ucunda küçük bir delik açmak için iğne uçlu forsepsleri kullanın.
      not: Biyolojik olarak tehlikeli malzemeleri işlemek için bu iğne uçlu forsepsleri kullanmayın.
   10. İmplant iğnesini bu deliğe ve kanülün açıklığı tamamen böbrek kapsülü tarafından kaplanana kadar böbrek boyunca kaydırın.
   11. Böbrek kapsülünün altındaki dokuyu nazikçe çıkarın ve iğneyi geri çekin. Timus parçaları yapışkan olabilir, bu nedenle timus parçasının iğne ile çıkmadığından emin olmak için kavisli forseps kullanın.
   12. Peritonu forseps ile kaldırın ve böbreği tekrar yerine itmek için hemostatı nazikçe kullanın. 4-0 vicryl emilebilir dikişler kullanarak peritona çift düğümlü bir dikiş atın. Cildi kapatmak için iki Autoclips sargı klipsi kullanın.
   13. Enjeksiyon için bir kenara bırakılan transdüksiyonlu CD34 + hücrelerini karıştırın ve 100 μl (0.5x10⁶ hücre) bir insülin şırıngasına alın. Bu hücreleri retroorbital ven enjeksiyonu veya diğer intravenöz enjeksiyon yolları yoluyla fareye enjekte edin. Pamuklu bir bez kullanarak, her göze küçük bir damla Suni Gözyaşı damlatın ve fareyi bir kafese yan yatırın.
   14. Tüm fareler implante edildikten sonra, hayvanların onları terk etmeden önce bilinçlerini yeniden kazandıklarını ve normal şekilde yürüdüklerini doğrulayın.
   15. Ameliyat sonrası bakım: Ameliyattan sonraki gün her fareye deri altından 0.3 ml seyreltilmiş Carprofen (6 mg / kg) ve 1.2 ml steril salin enjekte edin. Ameliyattan 2 ve 3 gün sonra, her fareye deri altından 1.5 ml steril salin enjekte edin. Ameliyattan sonra 10-14 gün boyunca fareleri ve insizyonları izleyin. Autoclips'i çıkarın ve fareleri 10-14 gün sonra tartın. not: Fareler radyasyondan sonra halsizdir ve tuzlu su enjeksiyonu hayvanların susuz kalmasını önler.
   16. 8-10 hafta sonra, fareleri kanayarak ve periferik kan üzerinde FACS analizi yaparak, CD45, CD3, CD4, CD8 gibi belirteçler ve vektörün ifade etmesi gereken herhangi bir gen için boyama yaparak aşılamayı kontrol edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CD34 mikro boncuk kiti	Miltenyi	130-046-702	İnsan CD34+ progenitör hücrelerini sıralamak için
Bambanker	Wako (Vahşi)	302-14681	hücreleri dondurmak için
QIAamp Viral RNA kiti	Keçi	52904	Serumdaki viral yükü ölçmek için
MACSKüküren Akış Sitometresi	Miltenyi		Akış analizi için
BD LSRFortessa™	BD biyolojik bilimler		Akış analizi için
Hyaluronidaz	Sigma	H6254-500MG	Doku sindirimi için
Deoksiribonükleaz I	Worthington	LS002006	doku sindirimi için
Kollajenaz	Yaşam teknolojisi	17104-019	doku sindirimi için
CFX Gerçek zamanlı PCR tespit sistemi	Biyorad		Viral yükü ve gen ekspresyonunu ölçmek için
Fareler, NOD suşu. Cg-Prkdcscid il2rgtm1Wjl/szJ	Jackson Laboratuvarı	5557	İnsanlaştırılmış fareleri inşa etmek için
Penisilin Streptomisin (Kalem Strep)	Thermo Fisher Bilimsel	10378016	Hücreleri kültürlemek için
piperasilin / tazobaktam	Pfizer	Zosyn Belediyesi	Mantar önleyici
Amfoterisin B (Mantar zonu antimikotik)	Thermo Fisher Bilimsel	15290-018	Mantar önleyici
AUTOCLIP Yara Klipsi, 9 mm - 1000 adet	Becton Dickinson'ın fotoğrafı.	427631	Ameliyat için
Steril Poli Takviyeli Aurora Cerrahi Önlükler, vaka başına 30	Medline (Medline)	DYNJP2707	Ameliyat için
Sütürler, 4-0, vicryl	Owens ve Küçük	23000J304H	Ameliyat için
Alkol hazırlama pedleri	Owens ve Küçük	3583006818	Ameliyat için
Eldiven, cerrahi, 6 1/2	Owens ve Küçük	4075711102	Ameliyat için
Yssel'in Serumsuz T Hücreli Ortamı	Gemini Biyo-ürünleri	400-102	CD34+ hücre transdüksiyonu için
İnsan Serum Albümini	Sigma-Aldrich	A9511	CD34+ hücre transdüksiyonu için

sayılı Kanun Hükmünde Kararname adet arası Gazetesi Serisi