Kemik İliği Kök Hücrelerinden Plazma Zarı Veziküllerinin Üretilmesi

Abstract

Kaynak: Xu, L. ve ark., Potansiyel Sitoplazma Replasman Tedavisi için Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinden Plazma Zarı Veziküllerinin Hazırlanması.J. Vis. Uzm. (2017)

Bu videoda, kemik iliği kök hücrelerini bir membran filtreden hızlı bir şekilde geçirerek plazma zarı vezikülleri oluşturmak için bir yöntem gösterilmektedir. Bu PMV'ler sitoplazma replasman tedavisi için potansiyel gösterir.

Protocol

1. Aparatın montajı

1. Steriliteyi sağlamak için, kullanmadan önce bir doku kültürü başlığının ultraviyole (UV) ışığını 30 dakika boyunca açın.
2. Tek kullanımlık 25 mm'lik bir filtre ünitesini sökün ve ünitenin kapağını ve altını 30 dakika boyunca %75 etanol ile doldurulmuş 200 mL'lik bir cam bardağa daldırın. Ünite tıbbi sınıf polipropilenden yapılmıştır.
3. Forseps kullanarak ünitenin kapağını ve altını kaldırın, kalan etanolü elinizle silkeleyin ve parçaların davlumbazda 10 dakika kurumasını bekleyin.
4. 19 mm'lik bir polikarbonat membranı fosfat tamponlu tuzlu su içinde (PBS) ıslatın ve ünitenin altındaki destekleyici matrisin üzerine dikkatlice yerleştirin. Polimer film pürüzsüz, düz bir yüzeye ve iz ile oyulmuş 3 μm gözeneklere sahiptir.
5. Kapağı tabana sıkıca vidalayarak üniteyi yeniden monte edin. Membranın merkezden ayrılmadığından emin olun.
6. 1 mL insülin şırıngasının iğnesini çıkarın ve 1 mL PBS çekin. Şırıngayı filtre ünitesine takın ve ardından düzeneği ıslatmak ve herhangi bir sızıntı olup olmadığını test etmek için PBS'yi ünitenin içinden itin.

2. Plazma Membran Veziküllerinin (PMV'ler) Üretilmesi

1. Nemeth ve ark. tarafından bildirildiği gibi, Dulbecco'nun %15 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin / streptomisin içeren Modifiye Eagle Medium (DMEM) kültür ortamında bir kemik iliği mezenkimal kök hücre (BMSC) kültürü oluşturun. Hücreleri, 37 ° C'de% 5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 6 oyuklu bir plakada yetiştirin.
2. Hücreleri çoğaltmak için, kültür ortamını çıkarın ve kuyuyu 0.5 mL kalsiyum içermeyen PBS ile durulayın.
3. 0.5 mL %0.25 tripsin-etilendiamin tetraasetik asit (tripsin-EDTA) ekleyin ve hücreleri 37 °C'de 3 dakika inkübe edin. Hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için plakayı avucunuzun içine birkaç kez vurun. 1 mL kültür ortamı ekleyerek sindirimi durdurun.
4. Hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın ve tezgah üstü santrifüjde 2 dakika boyunca 200 x g'da döndürün. Hücreleri 4 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri 6 oyuklu bir plakanın iki oyuğuna alikot edin.
   not: Hücreler genellikle yaklaşık 24 saatte birleşir.
5. PMV'ler oluşturmak için, hücreleri tripsin sindirimi ile 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğundan (yaklaşık 5 x 10⁵ hücre) hasat edin ve hücreleri 0.5 mL kültür ortamında monodispersiyon haline getirin.
6. Hücreleri insülin şırıngasına yükleyin, filtre ünitesine takın ve hücreleri filtreden sıkmak için pistonu hızlı bir şekilde itin. Ekstrüde edilmiş ortamı atın çünkü içinde yalnızca birkaç PMV olmalıdır.
7. Şırıngaya fazladan 0,5 mL ortam yükleyin ve hızlı bir şekilde filtreden itin. Çeşitli boyutlarda PMV'ler içeren ikinci ekstrüzyonun ortamını topladı.
8. Toplanan ortamın 150 μL'sini 35 mm'lik cam tabanlı bir tabağa yükleyin ve PMV'lerin yaklaşık 10 dakika boyunca dibe çökmesine izin verin. PMV'leri, 20X objektif lensi kullanarak bir CCD kamera ile donatılmış ters faz kontrast mikroskobu altında inceleyin.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
IsoporeTM membranlar	Kırlangıç	TSTP04700	3 mm gözenek
Tek kullanımlık filtre ünitesi	Xinya, Şanghay, Çin	25 Milimetre	Tıbbi sınıf polipropilen
İnsülin şırıngası	Bd	328446	1 ml