Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Oksotrofik Maya Suşları Oluşturmak için UV Mutajenezi
- Gerekli ultraviyole (UV) ışınlama dozlarını belirlemek için hayatta kalma eğrileri oluşturun
- YPD (maya özütü pepton dekstroz) ortamı ve Tablo 1'de listelenen diğer reaktifleri standart prosedürlere göre hazırlayın ve tek kolonileri 5-10 ml YPD ortamına aşılayın. Kültürleri bir silindir tamburu üzerinde 30 ° C O / N'de en az 8 saat doygunluğa kadar inkübe edin.
- Hücreleri plastik bir küvette su içinde 1:10 oranında seyrelterek bir spektrofotometre kullanarak gece boyunca (O/N) kültürlerin hücre konsantrasyonunu belirleyin. Hücreleri 20 ml steril damıtılmış su içinde 107 hücre / ml konsantrasyona seyreltin.
- Seyreltilmiş hücreleri steril bir plastik Petri kabına dökün ve kapak çıkarılmış olarak plakayı bir UV ampulünün 14 cm altına yerleştirin.
- Hücreleri seri 5.000 μJ ve 10.000 μJ UV ışınlamasına maruz bırakın, her artışın ardından 500 μl hücre çıkarın, böylece hücreler 0 μJ, 5.000 μJ, 10.000 μJ, 15.000 μJ, 20.000 μJ, 25.000 μJ, 30.000 μJ, 40.000 μJ, ve 50.000 μJ UV ışınımı. Ekstrakte edilmiş hücre örneklerini steril 1.5 ml'lik tüplere aktarın ve steril suda 1:10'luk artışlarla seri olarak seyreltin.
- Her seyreltmedeki pelet hücreleri, 1 dakika boyunca 16.000 x g'da bir mikrosantrifüjde santrifüjleme yoluyla Süpernatantı aspire edin ve maya hücrelerinin kaplanması için uygun olan 100 μl hacimde steril su içinde yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş hücrelerin tam hacmini YPD katı ortam içeren plakalara pipetleyin ve hücreleri her bir plakaya eşit olarak dağıtmak için steril bir yayıcı kullanın.
- Ortamın kurumasını önlemek için plaka kenarlarını Parafilm ile sarın ve UV kaynaklı mutasyonların foto-reaktivasyonunu ve onarımını önlemek için plakaları alüminyum folyoya sarın. Canlı maya kolonilerinin büyümesine izin vermek için plakaları 30 ° C'de 2-4 gün boyunca baş aşağı inkübe edin (Şekil 1).
- İsteğe bağlı olarak, sayılan kolonileri işaretlemek için bir kalem, elde taşınan bir elektronik sayaç kalemi veya büyütmeli bir sayaç standı yardımıyla koloni sayısını sayın. Işınlanmış maya için bir hayatta kalma eğrisi oluşturmak için her μJ UV ışınlama dozunda toplam kaplanmış hücrelerin yüzdesi olarak çizin (Şekil 2).
NOT: Haploid maya suşlarının, aynı yüzde sağkalıma ulaşmak için diploid suşlara göre daha düşük dozlarda UV ışınlaması gerektirmesi beklenebilir. Rad1 S. cerevisiae mutant gibi fonksiyonel DNA onarım enzimlerinden yoksun bir maya türü, çok düşük dozlarda UV ışınlamasının varlığını belirtmek için pozitif bir kontrol olarak kullanılabilir.
- 1.1.7'de oluşturulan sağkalım eğrisine bakarak tarama için kullanılacak UV mutajenez dozunu belirleyin. Hayatta kalma eğrisi boyunca y'nin 50'ye eşit olduğu noktanın x değeri, mayanın %50'sinin hayatta kaldığı UV ışınlama dozudur. Mutantların bu düşük sağkalım yüzdesinde taranması, özellikle diploid maya için başarılı şekilde mutasyona uğramış suşların daha yüksek verimine neden olabilir. Şekil 2'de gösterildiği gibi WT S. boulardii için% 50 hayatta kalma dozu yaklaşık 18.000 μJ'dir.
NOT: Bu kadar yüksek UV dozları, ilgilenilen oksotrofik belirteç geni dışındaki hücresel yollar için genlerde mutasyon riskini artırsa da, bu dezavantaj, oksotrofik belirteç geninin her iki kopyasında mutasyonları indükleme ihtiyacına karşı dengelenmelidir. Sadece bir gen kopyasının mutasyona uğraması gereken haploid suşlar için, %90 gibi daha yüksek bir sağkalım yüzdesinde tarama, ek mutasyon riskini azaltır ve yine de yeterli oksotrofik mutant üretimine izin verir.
- UV mutajenezi ve oksotrofik maya suşları için tarama
- Mayayı 1.1.1-1.1.3 adımlarında açıklandığı gibi hazırlayın.
- Mayayı, 1.1.8'de belirlendiği gibi% 50 sağkalıma karşılık gelen UV ışınlama dozuna maruz bırakın. WT S. boulardii için bu doz yaklaşık 18.000 μJ olarak belirlenmiştir (Şekil 2).
- 1 ml hacim UV ışınlanmış maya ve peleti, 1 dakika boyunca 16.000 x g'da bir mikrosantrifüjde santrifüjleme yoluyla toplayın. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 100 μl steril suda yeniden süspanse edin.
- Mutantların seçimi
- Ura3-oksotrofik mutantlarda olduğu gibi seleksiyon kullanılıyorsa, fonksiyonel bir Ura3 enzimi olmayan hücreleri seçmek için mayayı 5-floroorotik asit (5-FOA) içeren ortama plakalayın.
NOT: Ura3'ün fonksiyonel kopyalarını içeren herhangi bir maya, 5-FOA'yı toksin 5-florourasil'e dönüştürerek hücre ölümüne yol açar ve fonksiyonel bir Ura3'ten yoksun olan ura3 kolonilerinin kolay seçimine izin verir. LYS2 ve LYS5 için benzer seçim yaklaşımları mümkündür; TRP1;ve α-aminoadipik asit içeren ortamlar kullanılarak MET2 ve MET15 belirteçleri; 5-floroantranilik asit; ve sırasıyla metil cıva.
- 100 μl yeniden süspanse edilmiş hücreleri 5-FOA içeren minimum ortama pipetleyin ve plakayı eşit şekilde kaplamak için steril bir yayıcı kullanın. Plakaları Parafilme sarın ve canlı maya kolonilerinin büyümesine izin vermek için 2-4 gün boyunca 30 ° C'de baş aşağı inkübe edin.
- YPD, urasil ve 5-FOA plakalarına yeniden uygulayarak 5-FOA plakalarında görünen herhangi bir koloninin ura3-fenotipini doğrulayın (Şekil 3). Tek bir koloninin bir kısmını toplamak için steril bir kürdanın ucunu kullanın ve hücreleri taze YPD, urasil ve 5-FOA plakaları boyunca nazikçe sürükleyin. Yine, sarılmış plakaları 2-4 gün boyunca 30 ° C'de baş aşağı inkübe edin.
NOT: Canlı koloniler kabarık, kabaca dairesel büyümeler olarak görünürken, canlı olmayan hücreler herhangi bir kabarık büyüme olmaksızın sadece opak bir yayma olarak görünecektir (Şekil 3).
- Mutantların taranması
- Seçim yöntemlerinin mevcut olmadığı bir oksotrofik mutant oluşturuluyorsa, steril suda UV ışınlanmış maya hücrelerinin seri 1:10 dilüsyonlarını hazırlayın ve plakayı eşit şekilde kaplamak için steril bir yayıcı kullanarak seyreltmeleri YPD ortamına pipetleyin.
- Plakaları Parafilme sarın ve 2-4 gün boyunca 30 ° C'de baş aşağı inkübe edin. Birbirinden kolayca ayırt edilebilen, genellikle plaka başına yaklaşık 100 koloniden fazla olmayan bireysel kolonilerin büyümesine hangi seyreltmenin izin verdiğini belirleyin.
- 1.2.1-1.2.3'te tarif edildiği gibi maya örneklerinin UV mutajenezini ve bu belirlenen seyreltmede plaka hücrelerini tekrarlayın. Seyreltilmiş mayayı YPD ortamına pipetleyin, hücreleri dağıtmak için steril bir yayıcı kullanın ve sarılmış plakaları 2-4 gün boyunca 30 ° C'de baş aşağı inkübe edin.
- İlgilenilen metabolitten yoksun seçici ortam üzerine replika kaplama ile oksotrofları tarayın. İlk olarak, steril bir kadife pedi bir plaka standına sabitleyin ve UV ışınlanmış kolonilerle plakayı kadife üzerine ters çevirin ve plaka yönünü işaretleyin.
- Daha sonra, ilgilenilen metabolitten yoksun taze bir plakayı kadife üzerine ters çevirin ve hücreleri kadifeden tabağa aktarmak için hafifçe bastırın. Orijinal plakayı 4 °C'de saklayın. Yeni plakayı 2-4 gün boyunca 30 °C'de baş aşağı sarın ve inkübe edin.
- Replika kaplamaya bir alternatif olarak, YPD'den seçici ortama kolonileri yeniden çizerek mutantları eleyin. Tek bir koloninin bir kısmını toplamak için steril bir kürdanın ucunu kullanın ve hücreleri taze bir YPD plakası ve ilgilenilen metabolitten yoksun bir plaka boyunca nazikçe sürükleyin. Tekrar sarılı plakaları 2-4 gün boyunca 30 ° C'de baş aşağı inkübe edin.
NOT: Gerçek oksotrofik hücrelerin homojen bir popülasyonunu doğrulamak için tek kolonilerin seçilmesine ve kolonilerin birden çok kez çizgilenmesine özen gösterilmelidir.
- Ayrıca, tek kolonileri hem YPD'nin 5-10 ml'sine hem de uygun metabolitten yoksun ortama (örneğin, bir ura3-mutant için urasil-ortamda) aşılayarak ışınlanmış hücrelerin fenotipini doğrulayın. YPD ortamındaki hücrelerin büyümesini doğrulamak için 30 ° C O / N'de bir silindir tambur üzerinde inkübe edin, ancak metabolitin yokluğunda değil.
NOT: Katı ortam üzerindeki büyüme paternleri maya oksotrofik durumunu açıkça gösterse de, bazı mayaların stresleri tolere etmesi ve katı ortam üzerinde küçük, yavaş büyüyen koloniler oluşturması mümkündür, ancak yine de sıvı ortamda aynı koşulları tolere edemez (yayınlanmamış gözlemler). Bu nedenle, UV ışınlanmış mutantların büyüme modellerini tam olarak doğrulamak için sıvı kültürlere aşılama yapılmalıdır.
- Doğrulanmış oksotrofik mutantların uzun süreli depolanması için, hücreleri 10 ml YPD'ye aşılayarak ve 30 ° C'de bir silindir tambur O / N üzerinde inkübe ederek gliserol stokları hazırlayın. 2.500 x g'da 3 dakika santrifüjleme ile pelet hücreleri ve aspire ortamı. Hücreleri %50 steril filtrelenmiş gliserolde yeniden süspanse edin, bir kriyoviyal aktarın ve -80 ° C'de saklayın.
NOT: UV mutajenize maya, ilgilenilen oksotrofik belirteç dışında potansiyel olarak birden fazla gende mutasyonlar içerir. Doğrulanmış oksotrofik mutantların kullanımına devam etmeden önce, bu suşlar, başka bir yerde açıklandığı gibi, gen dizilimi ve pH, safra asidi stresleri ve probiyotik suşlarla ilgili diğer özelliklere karşı direncin değerlendirilmesi yoluyla daha fazla analiz edilmelidir2. Ek olarak, oksotrofik belirteçleri daha seçici bir şekilde mutasyona uğratmak için pcr homolojisi veya CRISPR/Cas9 hedeflemesinin kullanılması UV mutajenezine bir alternatif olarak düşünülmelidir.
2. Maya Dönüşümü
- Mayanın LiOAc Dönüşümü
- Tek maya kolonilerini 5-10 ml YPD ortamına aşılayın ve 30 ° C O / N'de bir silindir tambur üzerinde inkübe edin.
- Log faz büyümesini indüklemek ve plazmid alımının verimliliğini artırmak için, plastik bir küvette steril suda hücrelerin 1:10 oranında seyreltilmesini ölçmek için bir spektrofotometre kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin. O / N kültürlerini 50 ml taze ılık YPD'de 600 nm'de (OD600) 0.16-0.2 (yaklaşık 2 x 106- 2.5 x 106 hücre / ml) optik yoğunluğa seyreltin ve hücreleri, kültür yaklaşık 1 x 107 hücre / ml'ye ulaşana kadar 200 rpm'ye ayarlanmış bir orbital platform çalkalayıcı üzerinde inkübe edin, Genellikle 4 saat civarındadır.
NOT: Dönüşüm verimliliği, μg plazmit DNA başına başarıyla dönüştürülmüş maya kolonisi oluşturan birimlerin (CFU) sayısının bir fonksiyonu olarak ölçülebilir. Artan verimlilik, μg plazmit DNA başına daha fazla dönüştürülmüş koloni ile sonuçlanır. Maya hücrelerinin alt kültürlenmesi ve log faz büyümesi sırasında toplanması, dönüşüm verimliliğini artıran bir faktördür.
- 3 dakika boyunca 2.500 x g'da santrifüjleme ile pelet hücreleri.
- Süpernatanı aspire edin ve peleti 1 ml steril suda yeniden süspanse ederek hücreleri 1.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Bir mikrosantrifüjde 1 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleme ile pelet hücreleri, süpernatanı aspire edin ve hücreleri 1 ml TE / LiOAc (Tris EDTA / lityum asetat) tamponunda yeniden süspansiyon yoluyla yıkayın.
- Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve TE / LiOAc tamponundaki hücreleri 2 x 109 hücre / ml'lik bir konsantrasyona yeniden süspanse edin.
- Aşağıdakilerin her biri ile dönüşüm karışımları hazırlayın: TE / LiOAc tamponunda 50 μl hazırlanmış maya, 5 μl taşıyıcı DNA (10 μg / μl) ve 1 μl plazmit DNA (1 μg). Plazmid DNA'nın mikrogramları titre edilebilir, çünkü artan miktarda DNA dönüşüm verimliliğinin artmasına neden olabilir veya olmayabilir.
NOT: Bir oksotrofik markörü olmayan bir mutant maya suşu için, markörü kodlayan yalnızca bir plazmit numune başına dönüştürülebilir. Ayrıca, yeşil floresan proteini (GFP) gibi kolayca tespit edilebilir bir proteini kodlayan bir plazmidin kullanılması, transformasyonu takiben maya suşu tarafından heterolog proteinin uygun şekilde katlanmasının ve ekspresyonunun verimli bir şekilde belirlenmesine izin verecektir.
- Her hazırlığa 300 μl PEG/LiOAc/TE ekleyin ve iyice girdaplayın. Sağlam hücrelerin polietilen glikol (PEG) ile inkübe edilmesi, verimli dönüşüm için gereklidir.
- Preparatları 30 ° C'de 30 dakika boyunca çalkalama ile inkübe edin ve mikrosantrifüj tüplerini 200 rpm'de bir orbital platform çalkalayıcı üzerine yerleştirilmiş bir behere yerleştirin.
- Her reaksiyona 35 μl dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin ve şok hücrelerini 42 ° C'lik bir su banyosunda 15 dakika boyunca ısıtın. DMSO'nun ek yararına dair çelişkili raporlar olmasına rağmen, bozulmamış maya hücrelerinin ısı şokunun dönüşüm verimliliğini büyük ölçüde artırdığı gösterilmiştir.
- Hücreleri, 2.1.5'teki gibi santrifüjleme yoluyla peletleyerek, süpernatanı aspire ederek veya pipetleyerek ve 1 ml steril suda yeniden süspanse ederek yıkayın. Hücre peletini parçalamak için nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
NOT: Süpernatantın tamamen çıkarılması çok önemlidir, çünkü yetkin hücrelerin üretilmesinde kullanılan ortam maya büyümesini ve koloni oluşumunu engelleyebilir.
- Hücre peletlemeyi 2.1.5'teki gibi tekrarlayın, süpernatanı aspire edin ve hücreleri 100 μl steril suda yeniden süspanse edin. Tam hacmi seçici bir plakaya pipetleyin ve plakayı dönüştürülmüş maya ile eşit şekilde kaplamak için steril bir yayıcı kullanın.
- Ortamın kurumasını önlemek için kaplanmış plakaların kenarlarını Parafilm ile sarın ve dönüştürülmüş maya hücrelerinin büyümesine izin vermek için 2 gün boyunca 30 ° C'de baş aşağı inkübe edin. Saccharomyces cerevisiae'nin başarılı, verimli transformasyonu ve oksotrofik seçimi, transformasyon hazırlığı başına yüksek sayıda koloni verir, ancak verim diğer suşlar için çok daha düşük olabilir (Şekil 4).
- Maya plakalarını kısa süreli (genellikle 1-3 hafta) baş aşağı ve 4 ° C'de üstü kapalı olarak saklayın. Uzun süreli depolama için 1.2.5'te açıklandığı gibi dönüştürülmüş mayanın gliserol stoklarını hazırlayın.
NOT: Plazmit stabilitesini belirlemek ve heterolog proteinin uygun ekspresyonunu değerlendirmek için transforme CFU'yu test eden daha ileri çalışmalar gereklidir. Plazmid stabilitesinin kapsamlı açıklamaları, hücre örneklerinden geri kazanılan denatüre proteinleri tespit etmek için immünoblotlama kullanımı, uygun şekilde katlanmış üç boyutlu proteinleri tespit etmek için enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ve maya çalışmalarında GFP'nin kullanımı başka yerlerde mevcuttur. Şekil 5, transforme olmuş S. cerevisiae'de başarılı GFP ekspresyonunun temsili bir görüntüsünü göstermektedirdönüştürülmemiş hücrelere göre. Böyle bir floresan proteinin kullanılması, başarılı heterolog protein üretimini verimli bir şekilde belirlemenin bir yoludur.
- Mayanın Elektroporasyonu
- Tek maya kolonilerini 5-10 ml YPD ortamına aşılayın ve 30 ° C O / N'de bir silindir tambur üzerinde inkübe edin.
- Steril suda hücrelerin 1:10 oranında seyreltilmesini ölçmek için bir spektrofotometre kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin. O / N kültürlerini 100 ml taze ılık YPD ortamında yaklaşık 0.3'lük bir OD600 eşdeğerine seyreltin. Alt kültürleri 30 ° C'de, yaklaşık 1.6, genellikle 4-5 saat olan bir OD600'e ulaşana kadar 200 rpm'ye ayarlanmış bir orbital platform çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Her 100 ml alt kültür, iki transformasyon reaksiyonu için yeterli şartlandırılmış hücre üretecektir.
- 3 dakika boyunca 2.500 x g'da santrifüjleme ile pelet hücreleri. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 50 ml buz gibi soğuk steril suda yeniden süspanse ederek yıkayın. Hücreleri peletleyerek, süpernatanı aspire ederek ve taze 50 ml buz gibi soğuk steril suda yeniden süspanse ederek yıkamayı tekrarlayın.
- Hücreleri tekrar pelet haline getirin ve 50 ml buz gibi soğuk elektroporasyon tamponunda (1 M Sorbitol, 1 mM kalsiyum klorür (CaCl2)) yeniden süspanse edin.
- Dönüşü 2.2.3'teki gibi tekrarlayın, süpernatanı aspire edin ve hücreleri 20 ml 0.1 M LiOAc / 10 mM ditiotreitolde (DTT) yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu bir silindir tambur üzerinde 30 ° C'de 30 dakika inkübe edin. LiOAc ve DTT'deki hücrelerin ön inkübasyonu, elektroporasyonun verimliliğini sinerjik olarak artırır.
- Hücreleri 2.2.3'teki gibi peletleyin, süpernatanı çıkarın ve 50 ml buz gibi soğuk elektroporasyon tamponunda yeniden süspanse ederek yıkayın. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve hücreleri buz gibi soğuk elektroporasyon tamponunda 1 ml'lik bir son hacme kadar yeniden süspanse edin.
- Buz üzerinde hazırlayın: şartlandırılmış maya hücreleri, steril elektroporasyon küvetleri ve plazmid DNA. Şartlandırılmış hücrelerin 1 ml elektroporasyon tamponunda son resüspansiyonundan hemen sonra, 400 μl şartlandırılmış maya hücrelerini yaklaşık 1 μg plazmit DNA ile birleştirin ve buz gibi soğuk 0.2 μm elektroporasyon küvetine ekleyin. Artan miktarda DNA'nın kullanılması, dönüşüm verimliliğini biraz artırabilir. Reaksiyonu buz üzerinde 5 dakika inkübe edin, ardından 2,5 kV ve 25 μF'ye ayarlanmış elektroporatör ile elektroporasyon yapın.
NOT: 2.1.7'de açıklandığı gibi, bir oksotrofik markörden yoksun bir mutant maya suşu, numune başına mutasyona uğramış markörü kodlayan yalnızca bir plazmit ile dönüştürülebilir. Ayrıca, GFP gibi kolayca tespit edilebilir bir proteini kodlayan bir plazmidin kullanılması, transformasyonun ardından heterolog proteinin uygun şekilde katlanmasının ve ekspresyonunun verimli bir şekilde belirlenmesine izin verir.
- Elektroporasyonlu hücreleri 8 ml'lik 1: 1 M sorbitol karışımına aktarın ve hücrelerin 60 dakika boyunca 30 ° C'de bir silindir tambur üzerinde inkübe edilmesine izin verin.
- 2.2.3'teki gibi pelet hücreleri ve 100 μl 1: 1 YPD: 1 M sorbitolde yeniden süspansiyon haline getirilir. Tam hacmi 1 M sorbitol içeren seçici ortama koyun, plakaların kenarlarını Parafilm ile sarın ve dönüştürülmüş maya hücrelerinin büyümesine izin vermek için plakaları 30 ° C'de 2-5 gün boyunca baş aşağı inkübe edin.
NOT: 2.1.14 ve 2.2.7'de açıklandığı gibi heterolog proteinin uygun ekspresyonunu değerlendirmek için dönüştürülmüş mayayı test etmek çok önemlidir.
- Dönüştürülmüş Maya ile Farelerin Oral Gavajı
- Tüm hayvan bakım ve idare işlemlerini Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onayına göre gerçekleştirin.
- Dönüştürülmüş oksotrofik mayanın tek kolonilerini 5-10 ml seçici ortama aşılayarak O / N maya kültürlerini hazırlayın. Kültürleri O/N dönemini en az 8 saat boyunca bir silindir tambur üzerinde 30 ° C'de doymuş hale gelene kadar inkübe edin.
NOT: GFP gibi plazmit kodlayan test proteinlerinin kullanılması, 4.7'de açıklandığı gibi gazaşlı mayada protein ekspresyon testinin kolaylaştırılmasına izin verecektir.
- Protein ekspresyonunun maksimum indüksiyonu ve log faz büyümesini indüklemek için, 2.1.2'de tarif edildiği gibi 50 ml uygun ortamda yaklaşık 0.16-0.2'lik bir OD600 eşdeğerine seyrelterek O/N kültürlerinden alt kültürler hazırlayın.
- Alt kültürlenmiş hücrelerin konsantrasyonunu 1.1.2'deki gibi belirleyin ve 109 hücre / ml'ye ayarlayın. Doğruluğu ve numune yükleme kolaylığını artırmak için grup başına birkaç yüz μl ekstra hacim ile her fare için 100 μl'lik bir doz hazırlayın.
- 3 dakika boyunca 2.500 x g'da santrifüjleme veya 1 dakika boyunca 16.000 x g'da bir mikrosantrifüjde santrifüjleme yoluyla pelet hücreleri. Eşit hacimde steril su ekleyerek ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek süpernatanı aspire edin ve hücreleri yeniden süspanse edin.
- Uygun bir ölçü gavaj iğnesini (15-20 g fareler için 22 G) 1 ml'lik steril bir şırıngaya sabitleyin ve maya numunesi yükleyin, kabarcıkları ortadan kaldırdığınızdan ve pistonu 100 μl'lik bir artışa ayarladığınızdan emin olun. Kontrol farelerini tahrip etmek için steril su ile ek bir şırınga yükleyin ve herhangi bir kontamine maya olup olmadığını kontrol edin.
- İşaret parmağı ve başparmak boynun etrafındaki deriyi sıkıca kavrayacak şekilde, baskın olmayan elinizi kullanarak gavaj yapılacak fareyi kaldırın (Şekil 5A). Alt gövdenin hareket etmesini önlemek için kuyruğu küçük parmağın altına sokun. Gavaj sırasında iç dokulara zarar vermemek için tutamağın sağlam olduğundan ve farenin başını hareket ettirmesini yasakladığından emin olun.
NOT: Gavaj iğnesinin ne kadar uzağa yerleştirilmesi gerektiğini, ampul sternumun ksifoid işlemiyle eşit olacak şekilde fareye karşı tutarak tahmin edin. İğnenin bu uzunluğunun yerleştirilmesi tipik olarak gavaj iğnesi ampulünün mideye girmesine izin verecektir.
- Baskın eli kullanarak, iğneyi ağzın çatısı ve boğazın arkası boyunca, merkezin hafifçe soluna doğru tutarak gavaj iğnesini fare yemek borusuna nazikçe sokun. Farenin iğnenin ampulünü yutmasını bekleyin ve iğnenin 3.7'de tahmin edilen noktaya biraz daha inmesine izin verin (Şekil 5B). Gavaj iğnesinin yerleştirilmesi sırasında herhangi bir direnç hissedilirse veya fare herhangi bir zamanda nefes almaya başlarsa, iğneyi nazikçe çıkarın ve tekrar yemek borusunu bulmaya çalışın.
- Fare gavaj iğnesinin ampulünü yuttuktan sonra, 100 μl (108 CFU) mayayı doğrudan fare midesine uygulamak için şırınga pistonuna hafifçe bastırın.
NOT: Fareler uygulamadan sonra gavajlı çözeltinin hiçbirini kusamasa da, gavaj sırasında reflü meydana gelmesi mümkündür. Gavaj iğnesinin uygun şekilde yerleştirilmesinin yanı sıra çözeltinin hacminin ve viskozitesinin ayarlanması, reflüyü sınırlamaya ve doğru dozlamayı sağlamaya yardımcı olabilir.
- Gavaj iğnesini fare midesinden ve yemek borusundan dikkatlice çıkarın ve fareyi kafese geri koyun. Gavaj iğnesinin prosedür boyunca düzgün bir şekilde yerleştirildiğinden ve herhangi bir çözelti aspire edilmediğinden emin olmak için farenin gavajdan sonra nefes alıp vermediğini ve normal şekilde hareket ettiğini kontrol edin.
Tablo 1. Reaktifler Listesi. Bu el yazmasındaki protokoller için kullanılan çözeltilerin, maya ortamının ve plakalarının ve dönüşüm tamponlarının her birini yapmak için gereken reaktifler açıklanmıştır.
| Çözümleri | Maya Besiyeri ve Plakaları | Dönüşüm Reaktifleri |
| Polietilen glikol (PEG) %50: | YPD: | TE/LiOAc: |
| 250 g PEG 3350 | 20 gr pepton | 50 ml 10x TE |
| 500 ml steril su | 20 g dekstroz | 50 ml 10x (1M) LiOAc |
| Filtre sterilize edildi | 10 g maya özü | 400 ml steril su |
| 1 L su | Filtre sterilize edildi |
| otoklav | |
| TE 10x: | YPD plakaları: | PEG/TE/LiOAc: |
| 100 mM Tris | 20 gr pepton | 400 ml %50 PEG |
| 10 mM EDTA | 20 g dekstroz | 50 ml 10x TE |
| pH 7,5'e kadar ve filtre sterilize edilir | 20 g agar | 50 ml 10x (1M) LiOAc |
| 10 g maya özü | |
| 1 L su | |
| otoklav | |
| % 20 glikoz: | Urasil- seçici medya | Taşıyıcı DNA (SS DNA): |
| 200 gr dekstroz | Urasil içermeyen 2 g amino asit karışımı | Telleri eritmek ve buz üzerinde saklamak için -20 °C'de ve kullanmadan önce 100 °C'de 1-2 dakika ısıtın |
| 1 L su | 6.7 g amino asitsiz maya azot bazı | |
| Filtre sterilize edildi | 1 L su | |
| Otoklavlama veya steril filtreleme ile sterilize edin | |
| Kullanmadan önce 1:10 oranında %20 glikoz ekleyin | |
| % 50 gliserol: | Urasil- plakalar: | Elektroporasyon tamponu: |
| 500 ml gliserol | 250 ml'lik bir şişede: | 1 M Sorbitol |
| 500 ml su | Urasil içermeyen 2 g amino asit karışımı | 1 mM CaCl2 |
| otoklav | 6.7 g amino asitsiz maya azot bazı | Damıtılmış su ile doldurun |
| 150 ml su | Otoklavlayın ve 4 °C'de saklayın |
| 2 L'lik bir şişede: | |
| 20 g agar | |
| 750 ml su | |
| Otoklav şişeleri ayrı ayrı, daha sonra 100 ml% 20 glikoz ile karıştırın | |
| IMDM'yi tamamlayın | 5-FOA+ plakaları: | LiOAc/DTT |
| 500 ml Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Besiyeri | 2 L'lik bir şişede otoklav: | 0,1 M LiOAc |
| 5 ml penisilin streptomisin glutamin 100x | 20 g agar | 10 mM DTT |
| 500 μl 2-merkaptoetanol | 750 ml su | |
| % 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu | karışım: | |
| 2,5 ml sodyum piruvat 100 mM | 6.7 g amino asitsiz maya azot bazı | |
| Urasil içermeyen 2 g amino asit karışımı | |
| 150 ml ılık su | |
| Soğuyunca ekleyin: | |
| 0.05 g urasil tozu | |
| 1 g 5-FOA | |
| Karıştırın ve süzün, sterilize edin | |
| Otoklavlanmış agar çözeltisine ekleyin | |
| 100 ml %20 glikoz ile karıştırın | |
