Anti-anjiyojenik tümörle ilişkili nötrofillerin üretilmesi

Özet

Kaynak: Pylaeva, E., et al. Manipüle Edilmiş Tümörle İlişkili Nötrofillerin Anjiyojenik Potansiyellerini In Vivo Olarak İncelemek İçin Tümör Taşıyan Farelere Transferi. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, anti-anjiyojenik tümörle ilişkili nötrofiller (TAN'lar) oluşturmak için bir test gösterilmektedir. Pro-anjiyojenik TAN'lar içeren bir murin melanom tümörü alındıktan sonra, tek hücreler floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) kullanılarak izole edilir ve anjiyogenezi uyarma kapasitesini azaltmak için bir nikotinamid fosforibosil transferaz (NAMPT) inhibitörü ile tedavi edilir.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

>NOT: Protokolün genel şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. B16F10 melanom hücre hattının hazırlanması

1. Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Ortamında (IMDMc: IMDM +% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) +% 1 penisilin-streptomisin) tam olarak% 90 birleşik tek tabakaya (yaklaşık 10 x 10⁶ hücre / T75 şişe) büyütülmüş mikoplazma negatif hücreleri hazırlayın.
2. Ortamı çıkarın ve hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın. Proteolitik ve kollajenolitik enzimler içeren 6 mL hücre ayırma solüsyonu uygulayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 37 ° C'de 2 dakika inkübe edin.
3. Kalan yapışık hücreleri alttan harekete geçirmek için şişeyi hafifçe vurun. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik tüplerde toplayın ve 7 dakika ve 20 ° C boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
4. Süpernatanı çıkarın ve peleti 1 mL PBS'de tekrar süspanse edin. 14 mL PBS ve santrifüj ekleyin (300 x g ve 20 ° C'de 7 dakika).
5. Süpernatanı çıkarın ve peleti 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
6. Hücreleri sayın ve enjeksiyon için 3 x 10⁶ / mL PBS (adım 2 için) veya 6 x 10⁶ / mL PBS (adım 6 için) konsantrasyonuna yeniden süspanse edin. Hücreleri en fazla 30 dakika buz üzerinde tutun.

2. Farelerde allojenik tümör modeli

1. Spesifik patojen içermeyen (SPF) koşullar altında tutulan 8-12 haftalık 10 dişi İfnar1-/- fare kullanın.
   not: Dişi fareler, deri altı tümör büyümesi modelinde tercih edilir, çünkü erkekler daha agresiftir ve bu nedenle tümör büyümesini etkileyen tümör bölgesinin ihlallerine eğilimlidir.
2. Farenin derisini elektrikli bir tıraş makinesi ile yan tarafa tıraş edin ve cildi% 70 etanol ile ıslatılmış doku ile dezenfekte edin.
3. Hazırlanan B16F10 melanom hücrelerini 1 mL'lik bir şırınga ve 0.4 x 19 mm'lik bir iğnede 3 x 10⁶ / mL PBS konsantrasyonunda (1. adıma bakınız) toplayın. Süspansiyonun 100 μL'sini deri altına enjekte edin.
   1. Her enjeksiyondan önce hücreleri iyice karıştırın. Tümör hücrelerini rahatsız etmemek için çapı 0,4 mm'den az olmayan iğneler kullanın.
4. Bir kafese 5 adede kadar fare yerleştirin ve 14 gün boyunca bir kumpas ile tümör boyutunu (uzunluk, genişlik ve derinlik) kontrol edin.
   not: Hayvan yönetmeliğine göre, tümör boyutu çapı 15 mm'yi geçmemelidir, daha büyük veya nekrotik/açık tümörü olan fareler önceden sakrifiye edilmelidir.
5. 14. günde, fareleri CO₂ odasında kurban edin.
6. Cildi% 70 etanol ile dezenfekte edin ve steril bir Petri kabında tümörleri makas ve forseps ile çıkarın. Tümörleri 50 mL'lik bir tüpte, Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unda (DMEMc: DMEM +% 10 FBS +% 1 penisilin-streptomisin) buz üzerinde tutun.

3. TAN izolasyonu

1. Tümörleri, oyuk başına 5 tümör olacak şekilde steril 6 oyuklu plakalara yerleştirin. Tümörleri steril makasla 2-3 mm'lik parçalar halinde kesin.
   1. Tümör başına 1 mL dispas / kollajenaz D / DNaz I çözeltisi (1 mL DMEMc'de 0.2 mg / 0.2 mg / 100 mg) ile sindirin. Nemli bir inkübatörde 37 °C, %5_CO2'de inkübe edin ve her 15 dakikada bir 3 kez iğnesiz 10 mL'lik bir şırınga ile karıştırın.
2. Sindirilmemiş lifleri çıkarmak için, hücreleri 100 μm filtrelerden geçirerek 15 mL'lik tüplere (tüp başına filtre başına bir kuyucuk) geçirin. PBS'yi 15 mL'ye ekleyin, tüpleri 460 x g'da, 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
3. Her tüpe 1 mL ekleyerek eritrositleri bir lizis tamponu (NH₄Cl 150 mM, KHCO₃ 10 mM, EDTA 0.1 mM, pH 7.3, 20 °C) ile parçalayın. İyice karıştırın ve tüm tüplerdeki çözeltiyi bir araya getirin. 11 mL buz gibi (4 ° C) DMEMc ile 2 dakika sonra reaksiyonu durdurun.
4. 460 x g'da, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Peletleri 15 mL soğuk PBS ile tekrar süspanse edin. 460 x g'da, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
5. Peleti 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin. 3 μL Fc blok antikoru (CD16 / CD32, stok 0.5 mg / mL) ekleyin ve 15 dakika buz üzerinde inkübe edin.
6. Antikor ekleyin: 10 μL Ly6G-fikoeritrin (Ly6G-PE, stok 0.2 mg / mL) ve 10 μL CD11b-allofikosiyanin (CD11b-APC, stok 0.2 mg / mL). 20 μL 6-Diamidin-2-fenilindol canlılık boyası (DAPI, stok 5 mg / mL) ekleyin ve karanlıkta buz üzerinde 30 dakika < br / > not: Canlılık boyaları ve antikorların floresan konjugatlarının başka bir kombinasyonu kullanılabilir.
7. 15 mL'ye kadar PBS ekleyin, 460 x g'da, 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
8. Peleti DMEMc'de yaklaşık 10 x 10⁶ / mL konsantrasyona yeniden süspanse edin ve buz üzerinde tutun.
9. CD11b⁺ Ly6G^hi alive (DAPI-negatif) nötrofilleri floresanla aktive edilmiş bir hücre sıralayıcı ile sıralayın (geçit stratejisi, bkz. Şekil 2).
   not: Sıralanmış hücreler için tüpü hücre süspansiyonlu ve tüpü DMEMc'li 4 °C'de tutun. Aşağıdaki optimum sıralama ayarlarını kullanın: 70 μm nozul, maksimum 22.000 olay/saniye eşik hızı ve 1-3 akış hızı.
10. Önerilen %>95 saflık için bir sitometre kullanarak sıralanan nötrofillerin saflığını kontrol edin.
11. Nötrofilleri 460 x g'da, 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. DMEMc'de sıralanan hücreleri 1 x 10⁶ / mL.
    konsantrasyonuna yeniden süspanse edin not: 14 günlük bir B16F10 tümöründe (10 mm çapında) beklenen nötrofil sayısı yaklaşık 3 x 10⁴ hücredir.

4. TAN'larda in vitro NAMPT inhibisyonu

1. FK866 (NAMPT inhibitörü) stoğunu dimetilsülfoksit (DMSO) içinde 100 mM'lik bir nihai konsantrasyonda hazırlayın.
2. Tohum, nötrofilleri (adım 3.11) 96 oyuklu bir U-alt plakanın (1.5 x 10⁵ nötrofil/oyuk) 2 oyuğuna sıraladı. Müdahale kuyusuna FK866 (100 nM'lik nihai konsantrasyon) ve kontrol kuyusuna DMSO ile eşit miktarda DMEMc ekleyin. Nemli bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO₂ 'de 2 saat inkübe edin.
3. 460 x g'da, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Her kuyucukta 200 μL PBS'de yeniden süspanse edin. 2 kez tekrarlayın.
4. 460 x g'da, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Ticari endotel hücre büyüme ortamında (4 μL / mL endotel hücre büyüme takviyesi, 0.1 ng / mL rekombinant insan epidermal büyüme faktörü, 1 ng / mL rekombinant insan bazik fibroblast büyüme faktörü, 90 μg / mL heparin ve 1 μg / mL hidrokortizon ile desteklenmiş) 0.2 x 106 hücre / mL (0.75 mL'de) (adım 5 için) nihai konsantrasyona veya PBS'de 0.6 x 10⁶ hücre / mL ( 0.25 mL'de).

Sonuçlar

Şekil 1. Protokolün şeması. Aşama 1. B16F10 melanom hücre hattının hazırlanması; 2. Farelerde allojenik tümör modeli; 3. TAN'ların tümörlerden izolasyonu; 4. TAN'larda in vitro olarak NAMPT'nin inhibisyonu; 5. Aort halkası testinde TAN'ların anjiyojenik özelliklerinin tahmini; 6. Allojenik tümör modelinde tedavi edilen nötrofillerin adoptif transferi; 7. Tümör büyümesinin izlenmesi, histolojik incelem...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
15 ml tüpler	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Almanya	6,25,54,502
50 ml'lik tüpler	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Almanya	227261
Otomatik pipet için 5ml / 10ml / 25ml steril uçlar	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Almanya	6006180 / 607180 / 760180
6 kuyulu düz tabanlı hücre kültürü plakası	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Almanya	8,33,920
96 kuyulu düz tabanlı hücre kültürü plakası	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Almanya	655180
96 kuyulu U-dip hücre kültürü plakası	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Almanya	65018
anti-fare CD11b	BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, ABD	553312	klon M1/70, APC konjuge, 0.2mg/mL
anti-fare Ly6G	BioLegend, Kaliforniya, ABD	127608	klon 1A8, PE konjuge, 0.2mg / mL
BD FACS AriaII	BD Biyobilimleri, Becton Dickinson, Franklin Lakes, ABD		Hücre sıralayıcısı
Kaliper	Vogel Almanya, Kevelaer, Almanya
Casy hücre sayacı	Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Almanya
Cell Trics 50μm / 100 μm steril filtreler	Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Almanya	04-004-2327 / 04-004-2328
Santrifüj Rotina 420 R	Andreas Hettich, Tuttlingen, Almanya	4706
Kollajenaz D	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Almanya	11088858001
DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindol, dilaktat)	BioLegend, Kaliforniya, ABD	422801	Stok: 5mg / ml
Dispase I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Almanya	D4818-2MG
DMEM (Ömer Çiçeğ	Gibco, Yaşam Teknolojileri/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, ABD	41966-029	DMEM tamamlandı: DMEM +% 10 FBS +% 1 penisilin-streptomisin
DMSO (Dimetilsufoksit)	WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Almanya	WAK-DMSO-10	CryoSure-DMSO
DNaz I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Almanya	DN25-100MG
DPBS (DPBS)	Gibco, Yaşam Teknolojileri/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, ABD	14190-094
Endotel hücre büyüme ortamı	PromoCell, Heidelberg, Almanya	C-22010
FBS (Fetal Sığır Serumu)	Biochrom, Berlin, Almanya	S0115 Serisi
Fc bloğu (Anti-fare CD16/32)	BD Pharmingen, Becton Dickinson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, ABD	553142	klon 2.4G2, Stok: 0.5mg/mL
FK 866 hidroklorür	Axon Medchem, Groningen, Hollanda	Akson 1546	Stok: 100 mM
Keçi Anti-Tavşan IgG H & L	Abcam, Cambridge, Birleşik Krallık	ab97075	Cy3-konjuge, Stok: 0.5 mg / mL
Heracell 240i CO2 İnkübatörü	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	51026334
IMDM	Gibco, Yaşam Teknolojileri/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, ABD	12440-053	IMDM tamamlandı: IMDM +% 10 FBS +% 1 penisilin-streptomisin
Isis GT420 tıraş makinesi	B. Braun Asculap, Suhl, Almanya	90200714
Matrigel Matrix bodrum membranı	Corning Yaşam Bilimleri, Amsterdam, Hollanda	7205011
Monoklonal Anti-Aktin, α-Düz Kas	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Almanya	F3777	FITC konjuge, stok konsantrasyonu hakkında bilgi yok
İğneler 0,4 mm x 16 mm	BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, ABD	302200
Yeni Yuva	Merck, Darmstadt, Almanya	HX67590916
Normal keçi serumu	Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları, West Grove, ABD	005-000-121
Penisilin Streptomisin	Gibco, Yaşam Teknolojileri/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, ABD	15140-122
Pipetus otomatik pipet	Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Almanya	9907200
ProLong DAPI ile Altın Antifade Mountant	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, ABD	P36935 Serisi
tavşan anti fare Laminin gama 1 zincir	Immundiagnostik, Bensheim, Almanya	AP1001.1	Stok konsantrasyonu hakkında bilgi yok
StemPro Accutase (Kök Pro Hassasiyet)	Gibco, Yaşam Teknolojileri/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, ABD	A1105-01
Steril tek kullanımlık neşter (no. 15)	MedWare, Napoli, ABD	120920
Şırınga 1 ml	BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, ABD	303172
Şırınga 10 ml	BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, ABD	309110
T75 steril hücre kültürü şişeleri	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Almanya	83,39,11,302

numaralı telefonu arayın Haber Bülteni Serisi Sertifikası Serisi (İngilizce) Serisi