Mycobacterium bovis BCG Üzerinde Hedef Antijenlerin Sunulması İçin Bir Avidin-Biotin Konjugasyon Tekniği

Özet

Kaynak: Liao, T. A., et al., Mycobacterium bovis BCG Aşısındaki Eksojen Antijenlerin Avidin-biotin Sistemi ile Genetik Olmayan Yüzey Dekorasyonu Yoluyla Ekspresyonu. J. Vis. Uzm. (2018).

Video, immünojenik özelliklerini geliştirmek için Mycobacterium bovis BCG'ye antijen yükleme tekniğini göstermektedir. Yöntem, bakteri yüzeyini ekzojen antijenlerle kaplamak için avidin-biotin sistemini kullanır.

Protokol

1. BCG Hücre Yüzeyinin Biyotinilasyonu

1. Middlebrook 7H9 suyunda BCG'yi %10 OADC (oleik asit, albümin ve dekstroz çözeltisi) ve %0.05 Tween 80 ile 37 ° C'de 50 rpm'de OD = 0.5-1.
   kadar bir çalkalayıcı platformda büyütün NOT: BŞG, biyogüvenlik seviyesi 2 olan bir patojendir ve BCG ile ilgili tüm deneyler uygun kişisel koruyucu donanıma sahip bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.
2. 10⁹ BCG'yi 500 μL buz gibi endotoksin içermeyen PBS ve% 0.1 Tween80 (PBST) (pH 8.0) ile 3 kez yıkayın. Steril endotoksin içermeyen PBS'de BCG peletini askıya alın.
3. Kullanmadan hemen önce, steril filtrelenmiş suda 1 mL 10 mM Sulfo-NHS SS biyotin hazırlayın.​
   1. Bakterileri 1 mL 0.5 mM Sulfo-NHS SS biyotin ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
4. Reaksiyona girmemiş biyotinilasyon reaktifini çıkarmak için etiketli bakterileri 500 μL buzlu soğuk PBST ile 3 kez yıkayın.
   1. Peleti 1 mL PBST'de yeniden süspanse edin.

2. Monomerik Avidin-Füzyon Proteininin Biyotinile BCG Yüzeyine Bağlanması

1. 5 x 10⁸ biyotinile BCG'yi Avi-protein (PBS-T'de 10 μg/mL final) ile çalkalayıcı platformunda oda sıcaklığında 1 saat karıştırın.
2. Bakterileri 500 μL buzlu soğuk PBST ile 3 kez yıkayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Endotoksin içermeyen RPMI 1640	Kök Hücre Teknolojileri	36750
Sülfo-NHS SS biyotin	Termo Balıkçı	21328
Middlebrook 7H9 suyu	BD Tanı Sistemleri	271310
OADC (Türkçe)	BD Tanı Sistemleri	B11886
Ara 80	Sigma-Aldrich	P1379 Serisi

Serisi Gazetesi