Beyin Kanseri Hücrelerine Karşı Bir İmmünoterapi Stratejisi Olarak Test β-Glukanı Analiz Etmek İçin Bir Test

Özet

Kaynak: Folgado-Dorado, C. ve diğerleri, Glioblastoma için İmmünoterapi Stratejisi Olarak Fungal β-Glukanın İzolasyonu ve Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2023)

Bu video, reaktif bir oksijen türü olan süperoksit radikallerinin üretimi için mikroglial hücreleri aktive etmek için β-glukanların kullanıldığı bir in vitro testi göstermektedir. Beyin kanseri hücrelerinde, üretilen reaktif oksidanlar, tümör hücresi proliferasyonunu aktif olarak baskılar ve hücre ölümünü indükler.

Protokol

β glukan kaynaklı mikroglia stimülasyonunun in vitro çalışması

1. 8 oyuklu odacıklı slaytlarda fare glioblastoma ve mikroglia hücrelerinin hücre kültürü

NOT: Bu protokol GL261 (glioblastoma) ve BV2 (mikroglia) hücre hatları için özeldir. Bununla birlikte, küçük değişikliklerle, bu adımlar potansiyel olarak diğer kanser ve bağışıklık hücresi dizilerini incelemek için kullanılabilir.

1. Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium'unu (DMEM) L-glutamin, 4.5 g / L D-glikoz ile modifiye edilmiş ve piruvat olmadan hazırlayın. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ekleyin. Malzemeyi 37 °C'de bir su banyosunda 15 dakika önceden ısıtın.
2. Dondurulmuş BV2 ve GL261 alikotlarını 2 dakika boyunca bir su banyosunda (37 ° C) çözdürün ve tamamen çözülmeden hemen önce laminer bir akış başlığına taşıyın ve hücreleri iki farklı steril T25 şişesine (her hücre hattı için bir tane) yerleştirin.
3. T25 şişelerini 37 °C'de, %5_CO2'de kültür birleşene kadar inkübe edin.
   not: Donma koşullarına ve kriyoprezervasyon altındaki süreye bağlı olarak, birleşmeye kadar geçen süre değişebilir. Bu hücre hatlarının bir T75 şişesinde birleşime ulaşması genellikle 3 ila 5 gün sürer.
4. BV2 hücre kültürü birleştikten sonra, onu 0.6 x 10⁶ hücre / kuyucuklu 8 oyuklu oda slaytlarına aktarın. 8 oyuklu hazne slaytlarını 24 saat inkübatörde tutun.
5. Mikroglia hücreleri 8 oyuklu oda slaytlarına kaplandıktan sonra, aynı protokolü GL261 hücreleri ile tekrarlayın.

2. Mikroglia'nın β-glukanlarla aktivasyonu

1. BV2 hücrelerini 72 saat boyunca 0.2 mg / mL konsantrasyonda dört farklı β-glukan (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ve H. erinaceus) ile kaplayın. Bir deney koşulu, kontrol grubu olarak hareket ederek tedavi edilmeden (normal ortam) kalmalıdır.
2. Süpernatanı 72 saat sonra bir pipetle toplayın ve kalan hacmi 0,20 μm'lik bir şırınga filtresinden geçirin. Ardından, süpernatanı -80 °C'de en az 24 saat dondurun.

3. GL261'in önceden etkinleştirilmiş mikroglia şartlandırılmış besiyeri ile işlenmesi

1. GL261, 8 oyuklu oda kızakları içinde% 80 birleştiğinde, 72 saat boyunca% 25'lik bir nihai hacim konsantrasyonunda β glukan ile muamele edilmiş mikroglial ortam ekleyin (toplam hacim: 250 μl / kuyu).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
8 kuyulu oda kaydırakları	Thermo Fisher, Amerika Birleşik Devletleri	171080
Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle medium'u Gluta MAXTM	Gibco, Yaşam Teknolojileri, Carlsbad, CA, ABD	10564011
Ekstenda (α- Amilaz/Glukoamilaz)	Novozymes, Danimarka
Fetal sığır serumu	Gibco, Yaşam Teknolojileri, Carlsbad, CA, ABD	A4736301
Fosfat tamponlu tuzlu su	Gibco, Yaşam Teknolojileri, Carlsbad, CA, ABD	1010-015
Penisilin / streptomisin	Sigma-Aldrich, St. Louis	P4458 Serisi
kuvöz	Eppedorf Belediyesi	Gökada 170S