$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Dalakların Farelerden İzolasyonu
- 1640 RPMI (Roswell Park Memorial enstitüsü) hazırlayın:% 10 fetal sığır serumu (FBS), 0.10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), 1 mM sodyum piruvat, 50 μM β-merkaptoetanol ve% 1 penisilin / streptomisin.
- CO2 inhalasyonu ile 10-12 haftalık C57bl / 6 erkek farelere ötenazi yapın. Farenin göğsüne ve yanlarına% 70 etanol püskürtün. Sol tarafta, dalağı ortaya çıkarmak için cildi ve periton boşluğunu dikkatlice açın.
- Küçük forseps kullanarak, bağırsakları ve karaciğeri dikkatli bir şekilde farenin sol tarafına hareket ettirin ve ince makas kullanarak dalağı nazikçe çıkarın.
not: Gastrointestinal sisteme verilen hasar kontaminasyona neden olabileceğinden bu adım çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
- Eksize edilen her dalağı 3 mL RPMI 1640 ortamı içeren etiketli 15 mL konik bir tüpe yerleştirin.
2. Dalaklardan Tek Hücreli Süspansiyonların Üretilmesi
NOT: Dalak, mekanik ayrışma ve enzimatik sindirimi birleştirerek tek hücreli bir süspansiyona ayrıştırılabilir.
- Hazırlanan RPMI 1640 ortamına kollajenaz D (1 mg / mL; 0.29 U / mg liyofilize) ve DNaz I (0.1 mg / mL) ekleyerek dalak sindirim çözeltisini hazırlayın (bkz. adım 1.1)
- Dalağı 3 mL dalak sindirim solüsyonu içeren bir C tüpüne (ayrışma tüpü) aktarmak için forseps kullanın.
- Mekanik ayrıştırma işlemini, üreticinin talimatlarına göre yarı otomatik bir homojenizatör kullanarak gerçekleştirin.
- C tüpünü yarı otomatik homojenizatöre yerleştirin ve C tüpünün dönen kola sıkıca yerleştirildiğinden emin olun. C tüpü yerleştirildikten sonra, 60 s.
için Spleen 04.01 protokolünü çalıştırmak için yarı otomatik homojenizatördeki başlat düğmesine basın
NOT: Mekanik ayrışma, 50 mL'lik konik bir tüpün üzerine 40 μm'lik bir filtre yerleştirilerek ve dalağın filtreden hafifçe öğütülmesiyle de gerçekleştirilebilir. Dalağı öğüttükten sonra, 40 μm filtreyi 10 mL RPMI ortamı ile durulayın.
- Mekanik ayrışmadan sonra, tüpü homojenizatörden ayırın ve enzimatik sindirimi gerçekleştirin. Numuneleri sürekli rotasyon (20 rpm) altında 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
- Çözeltiyi 40 μm'lik bir süzgeçten süzdükten sonra 50 mL'lik konik bir tüpe pipetleyerek aktarın. 40 μm'lik süzgeci 10 mL Dulbecco'nun PBS'si (dPBS) ile yıkayın. Hücreleri 300 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
- Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı tamamen aspire edin ve peleti 10 mL dPBS'de yeniden süspanse ederek yıkayın. 300 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
3. CD11c+ DC'lerin Splenic Tek Hücreli Süspansiyondan İzolasyonu
- Hücre peletini 5 mL dPBS'de yeniden süspanse edin ve bir hemositometre ve tripan mavisi dışlaması kullanarak hücre sayısını sayın.
- Hücreleri 300 x g'da, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyerek peletleyin.
- Süpernatanı tamamen aspire edin ve peleti 400 μL manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralama (MAC'ler) tamponunda yeniden süspanse edin.
- 1 x 108 hücre başına 100 μL CD11c mikro boncuk ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Hücre süspansiyonunu vorteksleyin ve buzdolabında 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
- Hücreleri yıkamak için 10 mL MAC tamponu ekleyin. 300 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı tamamen aspire edin ve 500 μL MAC tamponunda yeniden süspanse edin.
4. CD11c+ DC'lerin Manyetik Ayrımı
NOT: Manyetik ayırma, LS Sütunları ile donatılmış bir manyetik ayırıcı (Malzeme Tablosuna bakın) ile manuel olarak yapılır. Manyetik ayırma, otomatik bir manyetik ayırıcı ile otomatik olarak da yapılabilir. (Bkz. Malzeme Tablosu).
- LS sütununu MAC ayırıcısının manyetik alanına ve akışı toplamak için her sütunun altına 15 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin.
- LS kolonunu 3 mL tampon ile durulayın.
- Hücre süspansiyonunu her bir LS sütununa yerleştirin ve etiketlenmemiş hücreler içeren akışı toplayın.
- LS sütununu 3 mL MAC tamponu ile yıkayın ve içinden geçen etiketsiz hücreleri toplayın. LS sütununu 2 kez daha yıkayın.
- LS sütununu manyetik ayırıcıdan çıkarın. Her sütuna 5 mL MAC tamponu ekleyin ve LS sütununu temiz bir 15 mL konik tüpe sıkıca daldırarak manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri hemen yıkayın.
not: Yüksek saflıkta bir hücre süspansiyonu elde etmek için CD11c hücrelerinin çift izolasyonunu gerçekleştirmek önemlidir. Bu nedenle, 3.1 ile 4.5 arasındaki adımları yineleyin. ve saflık standartları için Şekil 4'e referans verin. Bu adım, CD11c+ hücrelerinin saflığını %90-95'e çıkarır.
- Tripan mavisi dışlamasını kullanarak bir hemositometrede CD11c + DC numarasını belirleyin. Hücre örneğini %0.4 tripan mavisi çözeltisi içinde 1:1 seyreltmede seyreltin.
NOT: Canlı olmayan hücreler mavi renkte boyanırken, canlı hücreler lekesiz kalacaktır.
- Bunu yapmak için, bir hemositometreyi 10 μL hücre örneği seyreltmesi ile dikkatlice doldurun ve 1 dakika inkübe edin.
- Canlı hücre sayısını belirlemek için yüklenen haznede 1 x 1 mm'lik2 karelik 4 karedeki hücreleri sayın.
5. CD11c+ DC'lerin İn Vitro Yüksek Tuz İşlemi
- 500 mL 1640 RPM'ye %10 FBS, 0.1 mM HEPES, 1 mM sodyum piruvat, 50 μM β-merkaptoetanol ve %1 penisilin / streptomisin ekleyerek DC kültür ortamını hazırlayın.
- 1.17 g NaCl'yi tartarak ve steril 50 mL'lik bir şahin tüpüne yerleştirerek 10x DC yüksek tuzlu hücre kültürü ortamı (400 mM) hazırlayın. 50 mL falcon tüpüne 50 mL steril DC hücre kültürü ortamı (adım 5.1'de hazırlanmıştır) ekleyin ve NaCl çözelti içinde olana kadar girdaplayın.
- Bir hücre kültürü davlumbazındaki 0,2 μm'lik bir filtreden vakum filtrasyonu kullanarak yüksek tuzlu DC kültür ortamını hemen filtreleyin.
- Her hücre süspansiyonunu dalaklardan 300 x g'da 4ºC'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Her hücre peletini DC kültür ortamında 1 x 106 hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin.
- 900 μL'lik (yaklaşık 1 x 106 hücreli) DC süspansiyonunu 24 oyuklu düz tabanlı bir Falcon plakasına pipetleyin. 190 mM'lik bir nihai sodyum konsantrasyonu için her bir oyuğa 100 μL yüksek tuzlu DC kültür ortamı ekleyin. Plakayı etiketleyin ve 48 saat boyunca 37 ° C'lik nemlendirilmiş CO2 inkübatöre yerleştirin.
6. Yüksek Tuzla İşlem Görmüş CD11c+ DC'lerin Evlat Edinme Transferi
- 48 saat boyunca in vitro stimülasyondan sonra, plakayı 37 ° C nemlendirilmiş CO2 inkübatörden çıkarın.
- CD11c+ DC'leri yeniden süspanse etmek için hücre kültürü ortamını yukarı ve aşağı pipetleyin. Tüm CD11c+ DC süspansiyonunu karşılık gelen etiketli 1.6 mL'lik bir tüpe pipetleyin. İyi kaplanmış her bir kişi için bu adımı tekrarlayın.
- Her bir CD11c + DC süspansiyonunu 300 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin. DC peletini 100 μL steril dPBS ile yeniden süspanse edin.
- DC süspansiyonunu 27 G 1/2 inç iğne ile donatılmış 1 mL'lik bir şırıngaya çekin.
- Stabil bir cerrahi düzlem elde etmek için saf erkek 10 haftalık C57bl / 6 fareleri% 2 izofluran altına yerleştirin. Pedal refleksi eksikliği ile anestezi seviyesini kontrol edin. Stabil bir cerrahi düzlem elde edildikten sonra, iğneyi yaklaşık 30 ° 'lik bir açıyla retro-orbital boşluğa yavaşça ve dikkatlice sokun.
not: Oküler hasarı önlemek için 27 G iğnenin eğimi gözden uzakta, aşağıyı göstermelidir.
- CD11c + DC süspansiyonunu (yaklaşık 1 x 106 hücre) yavaş ve yumuşak bir şekilde enjekte edin. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, göze zarar vermemek için bilinçli olarak iğneyi retro-orbital boşluktan dikkatlice çıkarın.
not: Enjeksiyondan sonra çok az kanama olmalı veya hiç kanama olmamalıdır. CD11c + DC'lerin evlat edinici transferi, bir I.V. enjeksiyon yöntemi (ör. Kuyruk damarı). Kontrol fareleri, normal tuz ortamında kültürlenen CD11c + DC'leri aldı.
- Fareleri burun konisinden çıkarın ve anesteziden iyileşme sırasında yaklaşık 30 dakika izleyin.